二甲雙胍對人胰腺癌細胞株CFPAC-1增殖與凋亡的影響

賀志龍 夏偉 馮璜 許春芳

二甲雙胍是一種傳統的口服降糖藥，一直用于2型糖尿病的治療。然而，2005年Evans等[1]通過流行病學研究首次報道了二甲雙胍能夠明顯地降低2型糖尿病患者的腫瘤發病率。后有多項實驗研究證實了二甲雙胍的抗腫瘤作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌等[2-4]。目前有臨床研究證實，二甲雙胍能顯著降低糖尿病患者患胰腺癌的風險[5-6]。本研究應用二甲雙胍干預人胰腺癌細胞株CFPAC-1，觀察干預后細胞增殖及凋亡的變化，探討二甲雙胍抗胰腺癌的相關機制。

材料與方法

一、CCK-8法檢測細胞增殖抑制率

人胰腺癌細胞株CFPAC-1由蘇州大學附屬第一醫院血研所惠贈，常規培養、傳代。取對數生長期細胞，并調整細胞密度為2.5×104/ml。96孔板的每孔中加入100 μl細胞懸液，培養24 h。棄培養液，分別加入含1、2.5、5、10、20、40、60 mmol/L二甲雙胍(Sigma公司)的培養液繼續培養24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液(日本同仁公司)10 μl，37℃孵育4 h。以未處理的細胞作為對照組，以培養液作為空白對照。每組設6個復孔。實驗結束后上酶聯免疫檢測儀檢測。以空白對照孔調零，測各孔450 nm波長處的吸光度值(A450值)。細胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)=(對照組A450值-處理組A450值)/對照組A450值×100%。實驗重復3次，取均值。

二、流式細胞儀分析細胞周期

細胞貼壁生長達80%融合時棄培養液，加入含10、20、40 mmol/L二甲雙胍培養液繼續培養48 h，以未處理細胞作為對照組。用含EDTA的胰酶消化后收集各組細胞，PBS洗滌、離心3次，加入 70%乙醇，置4℃過夜。PBS洗滌2次后，加入碘化丙啶(PI)染色液(碧云天公司)，置37℃避光溫浴30 min，上BIOLISA流式細胞儀分析細胞周期。實驗重復3次，取均值。

三、Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡

取10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理48 h及未處理的貼壁培養細胞，用不含EDTA的胰酶消化后收集各組細胞，PBS洗滌3次，加入1×Binding Buffer 500 μl、Annexin V-FITC(Molecular Probes公司)5 μl、PI 1 μl混勻，室溫避光反應15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次，取均值。

四、蛋白質印跡法檢測蛋白表達

收集10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理48 h及未處理的貼壁培養細胞，用裂解液裂解細胞獲取蛋白，用BCA比色法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白行蛋白質印跡法檢測磷酸化AMPK(p-AMPK)、脂肪合酶(FAS)、cyclin D1、Bcl-xl、Bax、caspase-3、survivin蛋白表達。兔抗人p-AMPK、FAS、Bcl-xl、Bax一抗均購自EPITMICE公司，鼠抗人caspase-3和cyclin D1抗體、兔抗人survivin抗體、鼠抗人β-actin單抗、羊抗兔及羊抗鼠二抗均購自碧云天生物技術有限公司。最后ECL發光，X膠片曝光、顯影和定影。應用圖像分析儀掃描，以目的條帶與內參β-actin條帶的灰度值比表示蛋白的相對表達量。

五、統計學分析

結 果

一、二甲雙胍對CFPAC-1細胞增殖的影響

二甲雙胍呈濃度及時間依賴性抑制人胰腺癌CFPAC-1細胞的生長(表1)，差異具有統計學意義(P值均<0.05)。培養48 h時的IC50濃度約為20 mmol/L。

注：與對照組比較，aP<0.05；與24 h抑制率比較，bP<0.05；與48 h抑制率比較，cP<0.05

二、二甲雙胍對CFPAC-1細胞周期的影響

10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理CFPAC-1細胞48 h后，G0/G1細胞比例顯著增多(表2)，G2/M期、S期細胞比例顯著減少，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

表2 二甲雙胍對CFPAC-1細胞周期的影響

三、二甲雙胍對CFPAC-1細胞凋亡的影響

10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理CFPAC-1細胞48 h后，細胞凋亡率分別為(13.77±1.31)%、(22.63±1.45)%、(32.97±3.19)%，較對照組的(3.01±0.49)%均有顯著增加(F=136.903，P<0.05，圖1)。

圖1 對照組(a)及10、20、40 mmol/L二甲雙胍(b、c、d)處理CFPAC-148 h后的凋亡細胞

四、二甲雙胍對CFPAC-1細胞相關蛋白表達的影響

不同濃度二甲雙胍處理CFPAC-1細胞48 h后，p-AMPK、Bax、caspase-3表達明顯增強，FAS、cyclin D1，Bcl-xl、survivin表達減弱(圖2，表3)，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，提示二甲雙胍處理后AMPK信號通路激活，細胞凋亡增加。

圖2 對照組(1)及10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理組(2、3、4)CFPAC-1細胞相關蛋白的表達

討 論

糖尿病與胰腺癌的關系復雜，一方面糖尿病是胰腺癌早期癥狀之一，另一方面糖尿病已經是僅次于吸煙、肥胖之后的胰腺癌發病的第三大危險因素[7-8]。作為治療2型糖尿病一線藥物的二甲雙胍在抗胰腺癌方面的研究顯得格外重要，并更具臨床意義。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，其磷酸化后形成的p-AMPK是AMPK的活化形式。AMPK是調節細胞能量代謝最重要的“傳感器”，激活的p-AMPK能夠抑制細胞能量代謝，抑制細胞合成蛋白質、脂肪酸等物質[9]，并可抑制AMPK信號通路下游多種因子的生成及活性，從而調節細胞周期、凋亡，最終影響腫瘤細胞的增殖[10]。在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等研究中發現，二甲雙胍抗腫瘤作用與激活AMPK信號通路有關[2,4]。本研究結果顯示，二甲雙胍處理CFPAC-1細胞48 h后能顯著增加p-AMPK表達量，提示二甲雙胍可激活AMPK信號通路。

FAS是脂肪酸生物合成過程中將小分子碳單位聚合成長鏈脂肪酸的關鍵酶。腫瘤細胞的脂肪酸代謝與正常組織細胞不同，其依賴于細胞內FAS來合成脂肪酸以滿足癌細胞分裂、增殖的需要[11]。在胰腺癌組織中FAS水平也顯著升高，并與胰腺癌的預后呈負相關[12]。本研究結果顯示，二甲雙胍處理CFPAC-2細胞后，FAS的蛋白下調，提示AMPK信號通路激活后可抑制FAS合成[13]。

表3 二甲雙胍處理CFPAC-1細胞48 h后相關蛋白的表達量

Cyclin D1在調控細胞增殖周期G1期到S期的轉換中起著重要的作用。有研究表明，二甲雙胍通過激活AMPK從而抑制mTOR，導致下游靶分子解磷酸化，進而下調cyclin D1的表達，將腫瘤細胞阻滯于G0/G1期[14-15]。本研究結果顯示，二甲雙胍處理CFPAC-1細胞后，G0/G1期細胞比例增多，S期及G2/M期細胞比例減少，證實二甲雙胍通過激活AMPK信號通路而下調cyclin D1的表達，阻滯細胞于G0期/G1期，抑制細胞增殖。

腫瘤的發生不僅與細胞增殖異常有關，同時也與細胞凋亡異常有密切關系。Bcl-xl是一種經典的凋亡抑制基因，Bax為凋亡促進基因，caspase-3則是凋亡途徑最終的效應因子。Bcl-xl/Bax比值下調可破壞線粒體外膜完整性，釋放細胞色素C等進入胞質，激活caspase-3，進而引起染色體斷裂、細胞凋亡[16]。survivin是一種凋亡抑制蛋白，可直接抑制caspase-3活性而有效阻斷細胞凋亡[17]。本研究結果顯示，二甲雙胍處理CFPAC-1細胞后Bcl-xl表達下調，Bax表達上調，Bcl-xl/Bax比值降低，survivin表達下調，caspase-3表達上調，從而誘導CFPAC-1細胞凋亡。

參 考 文 獻

[1] Evans JM, Donnelly LA, Emslie-Smith AM, et al. Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients[J]. BMJ, 2005,330(7503):1304-1305.

[2] Kato K，Gong J，Iwama H, et al. The antidiabetic drug metformin inhibits gastric cancer cell proliferation in vitro and in vivo[J]. Mol Cancer Ther, 2012, 11(3)：549-560．

[3] Wu N, Gu C, Gu H, et al．Metformin induces apoptosis of lung cancer cells through activating JNK/p38 MAPK pathway and GADD153[J]. Neoplasma, 2011, 58(6):482-490.

[4] Zhuang Y, Miskimins WK. Cell cycle arrest in Metformin treated breast cancer cells involves activation of AMPK, downregulation of cyclin D1, and requires p27Kip1 or p21Cip1[J]. J Mol Signal, 2008,3:18.

[5] Li D, Yeung SC, Hassan MM, et al. Antidiabetic therapies affect risk of pancreatic cancer[J]. Gastroenterology, 2009,137(2):482-488.

[6] Zhang P, Li H, Tan X, et al. Association of metformin use with cancer incidence and mortality: meta-analysis[J]. Cancer Epidemiol, 2013, 37(3): 207-218.

[7] Gullo L, Pezzilli R. Diabetes and pancreatic cancer[J]. Pancreas, 2004, 28(4):451.

[8] Fisher WE. Diabetes: risk factor for the development of pancreatic cancer or manifestation of the disease[J]? World J Surg, 2001, 25(4):503-508.

[9] Towler MC, Hardie DG. AMP-activated protein kinase in metabolic control and insulin signaling[J]. Circ Res, 2007, 100(3): 328-341.

[10] Ben Sahra I, Le Marchand-Brustel Y, Bost F, et al. Metformin in cancer therapy: a new perspective for an old antidiabetic drug[J]? Mol Cancer Ther, 2010, 9(5):1092-1099.

[11] Alo PL, Visca P, Trombetta G, et al. Fatty acid synthase (FAS) predictive strength in poorly differentiated early breast carcinomas[J]. Tumori, 1999,85(1):35-40.

[12] Witkiewicz AK, Nguyen KH, Dasgupta A, et al. Co-expression of fatty acid synthase and caveolin-1 in pancreatic ductal adenocarcinoma: implications for tumor progression and clinical outcome[J]. Cell Cycle, 2008,7(19):3021-3025.

[13] Steinberg GR, Kemp BE. AMPK in Health and Disease[J]. Physiol Rev, 2009, 89(3):1025-1078.

[14] Zhao L, Wen ZH, Jia CH, et al. Metformin induces G1 cell cycle arrest and inhibits cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Anat Rec (Hoboken), 2011, 294(8): 1337-1343.

[15] Chen HP,Shieh JJ,Chang CC,et al.Metformin decreases hepatocellular carcinoma risk in a dose-dependent manner:population-based and in vitro studies[J].Gut,2013,62(4):606-615.

[16] Breckenridge DG, Xue D. Regulation of mitochondrial membrane permeabilization by BCL-2 family proteins and caspases[J]. Curr Opin Cell Biol, 2004, 16(6): 647-652.

[17] Shin S, Sung BJ, Cho YS, et al. An anti-apoptotie protein human survivin is a direct inhibitor of Caspase-3 and -7[J]．Biochemistry，2001，40(4)：1117-1123.