Rho-GDI2在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

易彬 張逸 周健 宋世鐸 趙鑫 李德春

Rho-鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPases)蛋白家族，包括RhoA、RAC1和Cdc42，具有調(diào)控一系列調(diào)節(jié)生物過程的信號(hào)通路、參與促進(jìn)所有腫瘤的惡性生物學(xué)行為等作用[1-2]。

鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子2(Rho-GDP dissociation inhibitor2，Rho-GDI2)作為Rho-GTPases蛋白家族的重要調(diào)節(jié)因子之一，通過調(diào)節(jié)Rho-GTPases蛋白家族的分布及活性狀態(tài)，從而影響細(xì)胞的分裂、形態(tài)改變、遷移及侵襲能力、血管侵犯等生物學(xué)行為[1,3-5]。然而，關(guān)于Rho-GDI2的表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究檢測(cè)胰腺癌及配對(duì)癌旁組織中Rho-GDI2的表達(dá)，分析胰腺癌組織Rho-GDI2表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，探討Rho-GDI2在胰腺癌發(fā)生及發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

收集2006年至2012年蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的60例胰腺癌及其配對(duì)癌旁組織，部分用甲醛固定，部分置液氮罐凍存后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司，Master MixPCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，兔抗人Rho-GDI2多抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,山羊抗兔二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)(上海)有限公司。PCR引物采用PremierPrimer 5．0軟件設(shè)計(jì)，由美國(guó)Invitrogen公司合成。

二、方法

1．RNA提取和RT-PCR：取20例新鮮凍存胰腺癌組織及配對(duì)癌旁組織，用Trizol提取總RNA，隨后用AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再行RCR擴(kuò)增。引物序列：Rho-GDI2上游5′-ATGACTGAAAAAGCCCCA-3′，下游5′-TCATTCTGTCCACTCCTT-3′。內(nèi)參β-actin上游5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′，下游5′-CAGGGTACATGGTGGTGCTGCC-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠自動(dòng)成像儀拍照，灰度掃描，使用Quantity One軟件分析，以目的基因條帶與β-actin條帶灰度值比表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2．免疫組織化學(xué)染色：固定的組織經(jīng)石蠟包埋、切片，行常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。Rho-GDl2一抗及二抗工作濃度1∶50稀釋，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明和封片。染色的組織切片由兩名病理科醫(yī)師盲法讀片。結(jié)果判斷：以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，染色強(qiáng)度按無(wú)著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別計(jì)0、1、2、3分，陽(yáng)性著色面積按無(wú)著色及著色面積<1/3、1/3～2/3、>2/3分別計(jì)0、1、2、3分，將兩項(xiàng)得分相加，>3分為表達(dá)陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌及配對(duì)癌旁組織Rho-GDI2 mRNA表達(dá)

20例胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中Rho-GDI2 mRNA表達(dá)量分別為0.661±0.021、0.199±0.023(圖1)，癌組織顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.313，P<0.01)。

圖1 胰腺癌(T)及配對(duì)癌旁組織(NT)Rho-GDI2 mRNA的表達(dá)

二、胰腺癌及配對(duì)癌旁組織Rho-GDI2蛋白表達(dá)

Rho-GDI2陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，少部分陽(yáng)性染色定位于胞核(圖2)。胰腺癌組織Rho-GDI2陽(yáng)性表達(dá)率為73.3%(44/60)，且陽(yáng)性染色多呈棕黃色或棕褐色；配對(duì)癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率為41.7%(25/60)，且陽(yáng)性染色多呈淡黃色。胰腺癌組織Rho-GDI2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.310，P=0.001)。

圖2 胰腺癌組織(a)及癌旁組織(b)中Rho-GDI2蛋白的表達(dá) (免疫組化 ×400)

三、胰腺癌組織Rho-GDI2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胰腺癌組織Rho-GDI2蛋白表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤部位無(wú)相關(guān)性，而與腫瘤大小、分化程度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯等具有相關(guān)性(表1)。

表1 胰腺癌組織Rho-GDI2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

討 論

Rho-GDIs作為Rho-GTPases蛋白家族的重要調(diào)節(jié)因子，目前被確認(rèn)的有3種：Rho-GDI1(也稱作Rho-GDI或Rho-GDI-a)、Rho-GDI2(也稱為L(zhǎng)y-GDI或D4GDI或Rho-GDI-β)、Rho-GDI3(也稱為RhoGDI-γ)[6-8]。Rho-GDI1表達(dá)于哺乳類動(dòng)物的各臟器，Rho-GDI3表達(dá)于大腦、肺臟、腎臟、睪丸以及胰腺，Rho-GDI2一直以來被認(rèn)為特異性地表達(dá)于造血組織。近來研究發(fā)現(xiàn)Rho-GDI2在非造血組織腫瘤中也表達(dá)[9-11]。

Rho-GTPases家族有兩種結(jié)合狀態(tài)：(1)激活狀態(tài)：與GTP結(jié)合，定位于細(xì)胞膜，接受、傳遞、處理相應(yīng)的信號(hào)刺激；(2)失活狀態(tài)：與GDP結(jié)合，定位于細(xì)胞質(zhì)中，不能接受、傳遞、處理信號(hào)刺激。RhoGDI2通過抑制GDP與Rho-GTPases的解離，與大多數(shù)Rho-GTPases結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)中，使Rho-GTPases處于失活狀態(tài)，阻止其與效應(yīng)分子相互作用，因此，Rho-GDI2最初被認(rèn)定為Rho-GTPases蛋白家族的負(fù)調(diào)控因子。然而最近的研究表明，Rho-GDI2也可以與Rho-GTPases結(jié)合于細(xì)胞膜，通過抑制Rho-GTPases本身的GTPase活性以及GTPase激活蛋白(GAPs)的GTP酶活性，維持Rho-GTPases與GTP結(jié)合的激活狀態(tài)，對(duì)Rho-GTPases蛋白家族起正調(diào)控作用[12-15]。

腫瘤組織Rho-GDI2表達(dá)與其臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后關(guān)系的研究結(jié)果在不同腫瘤中不一致。有研究報(bào)道，Rho-GDI2表達(dá)水平與膀胱癌患者生存率呈正相關(guān)，且是膀胱癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[16]。乳腺癌患者的無(wú)病生存率和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率與Rho-GDI2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示Rho-GDI2高表達(dá)有促乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用，是患者預(yù)后差的標(biāo)記[17]。Rho-GDI2 mRNA低表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及大腸癌肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，高表達(dá)Rho-GDI2的腫瘤患者有著更長(zhǎng)的無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)生存期[18-19]。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌及癌旁組織均有Rho-GDI2的表達(dá)，但癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于相應(yīng)配對(duì)癌旁組織，癌組織Rho-GDI2 mRNA表達(dá)量也顯著高于配對(duì)癌旁組織。胰腺癌組織Rho-GDI2蛋白表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤部位無(wú)相關(guān)性，而與腫瘤大小、分化程度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯等相關(guān)，提示Rho-GDI2的表達(dá)與胰腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Sahai E, Marshall CJ. RHO-GTPases and cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(2):133-142.

[2] Lozano E, Betson M, Braga VM. Tumor progression:small GTPases and loss of cell-cell adhesion[J]. Bioessays, 2003, 25(5):452-463.

[3] Jaffer AB, Hall A. Rho GTPases in transfornmation and metastasis[J]. Adv Cancer Res, 2002, 84:57-80.

[4] Zhang Y, Zhang B. D4-GDI, a Rho GTPase regulator, promotes breast cancer cell invasiveness[J]. Cancer Res, 2006, 66(11):5592-5598.

[5] Cho HJ, Baek KE, Park SM. Rho GDl2 expression is associated with tumor grouth and malignant progression of gastric cancer[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(8):2612-2619.

[6] Fukumoto Y, Kaibuchi K, Hori Y, et al. Molecular cloning and characterization of a novel type of regulatory protein (GDI) for the rho proteins, ras p21-like small GTP-binding proteins[J]. Oncogene, 1990, 5(9):1321-1328.

[7] Scherle P, Behrens T, Staudt LM. Ly-GDI, a GDP-dissociation inhibitor of the RhoA GTP-binding protein, is expressed preferentially in lymphocytes[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90(16):7568-7572.

[8] Zalcman G, Closson V, Camonis J, et al. Rho GDI-3 is a new GDP dissociation inhibitor (GDI). Identification of a non-cytosolic GDI protein interacting with the small GTP-binding proteins RhoB and RhoG[J]. J Biol Chem, 1996, 271(48):30366-30374.

[9] Lelias JM, Adra CN, Wulf GM, et al. cDNA cloning of a human mRNA preferentially expressed in hematopoietic cells and with homology to a GDP-dissociation inhibitor for the rho GTP-binding proteins[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90(4):1479-1483.

[10] Adra CN, Manor D, Ko JL, et al. Rho GDI gamma: a GDP-dissociation inhibitor for Rho proteins with preferential expression in brain and pancreas[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 94(9):4279-4284.

[11] Gildea JJ, Seraj MJ, Oxford G. Rho GDI2 is an invasion and metastasis suppressor gene in human cancer[J]. Cancer Res, 2002, 62(22):6418-6423.

[12] Dovas A, Couchman JR. Rho GDI: multiple functions in the regulation of Rho family GTPase activities[J]. Biochem J, 2005, 390(Pt1):1-9.

[13] Der Mardirossian C, Bokoch GM. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation[J]. Trends Cell Biol, 2005, 15(7):356-363.

[14] Hart MJ, Maru Y, Leonard D, et al. A GDP dissociation inhibitor that serves as a GTPase inhibitor for the Ras-like protein CDC42Hs[J]. Science, 1992, 258(5083):812-815.

[15] Chuang TH, Xu X, Knaus UG, et al. GDP dissociation inhibitor prevents intrinsic and GTPase activating protein-stimulated GTP hydrolysis by the Rac GTP-binding protein[J]. J Biol Chem, 1993, 268(2):775-778.

[16] Theodorescu D, Sapinoso LM, Conaway MR, et al. Reduced expression of metastasis suppressor RhoGDI2 is associated with decreased survival for patients with bladder cancer[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(11):3800-3806.

[17] Moon HG, Jeong SH, Ju YT, et al. Up-regulation of Rho GDI2 in human breast cancer and its prognostic implications[J]. Cancer Res Treat, 2010, 42(3):151-156.

[18] Shida A, Fujioka S, Takahashi N. Reduced expression of Rho GDP dissociation inhibitor 2 mRNA is associated with lymph node metastasis in gastric carcinoma[J]. Oncol Lett, 2013, 6(2):463-467.

[19] Fujita A, Shida A, Fujioka S, et al. Clinical significance of Rho GDP dissociation inhibitor 2 in colorectal carcinoma[J]. Int J Clin Oncol, 2012, 17(2):137-142.