紫外-熒光分光光度法聯用測定熊果酸對胰脂肪酶的抑制作用

單 萍，趙淑娥

(1.江西省工業和信息化委員會信息中心，330046，南昌;2.江西省分析測試研究所，330029，南昌)

0 引言

肥胖嚴重危害人體健康，其產生與體內脂肪酶的活性有著密切的關系。在食物的消化吸收過程中，人體所攝入的大部分脂肪都是在脂肪酶的作用下，降解為甘油二酯、單甘油酯、甘油和脂肪酸，而后在小腸被吸收利用[1]。在這一過程中，胰脂肪酶起著重要的作用。如能有效控制胰脂肪酶的活性，便可減少食物中脂肪的消化吸收，從而有望控制和治療肥胖。雖然半合成的胰脂肪酶抑制劑類藥物奧利司他已作為減肥藥物廣泛應用于臨床，但長期服用該藥會出現腹瀉、脂肪性大便、胃腸脹氣等副作用[2]，而植物來源的天然化合物具有結構多樣性、毒性較低、來源廣泛等特點，因此從植物中篩選新的副作用更小的胰脂肪酶抑制劑一直是研究熱點。近年來，中草藥以其豐富的天然藥源，輕微的不良反應，確切的療效，獨特的作用機理，獨立的知識產權，較低的醫療成本等吸引人們的注意[3]。

熊果酸(Ursolicacid)又名烏索酸(烏蘇酸)，屬五環三萜類化合物。它在自然界分布很廣，如存在于杜鵑花科植物熊果的葉、果實中與玄參科植物毛泡桐的葉中，以及木樨科植物女貞的葉中。熊果酸具有廣泛的生物活性，包括抗癌、對肝損傷的保護、抗菌消炎和抗病毒等作用;同時，熊果酸及其衍生物還對病毒具有抑制活性[4]。因此，熊果酸的藥理學活性越來越引起藥物專家們的關注，熊果酸降脂減肥的作用機理鮮見報道。本試驗旨以熒光分光度計為主要儀器，研究熊果酸對胰脂肪酶的抑制特性，為進一步探討熒光分光光度法在控制肥胖的機理及熊果酸等抑制劑的研發提供方法和基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

pHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠);F-4500型熒光光度計(日本日立公司);UV-2600型紫外可見分光光度計(尤尼柯)。

豬胰脂肪酶(Sigma公司)，溶于Tris-HCl(pH 8.0)緩沖溶液中存于冰箱中備用，4-硝基苯棕櫚酸酯(PNPP)、熊果酸(分析純，阿拉丁試劑，結構式見圖1)。8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)(Sigma公司)。

圖1 熊果酸的分子結構式

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外分光光度法測定熊果酸對胰脂肪酶的抑制作用 脂肪酶活性檢測原理:脂肪酶水解4-硝基苯棕櫚酸酯(PNPP)產生 4-硝基苯酚(PNP)和棕櫚酸，PNP在水溶液中顯黃色，在405 nm有最大的光吸收，通過測定PNP在405 nm處的光吸收可測得脂肪酶的活力[5，6]。

取不同濃度的熊果酸0.1 mL和0.05 mL胰脂肪酶溶液(2 U/mL)混勻在50 mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖溶液中，在37℃水浴10 min后，加入底物0.05 mL PNPP(0.5 mM)啟動反應。利用紫外分光光計每分鐘測定405 nm波長處PNP的生成量，以不加熊果酸的反應體系作為空白，根據公式(1)計算抑制率

式中:R0為無抑制劑時的吸光度變化的斜率;R為在含有不同濃度熊果酸的體系中的吸光度變化的斜率。

1.2.2 紫外分光光度法測定熊果酸對胰脂肪酶的抑制動力學研究 固定胰脂肪酶的加入量，改變底物的濃度，測定在不同熊果酸濃度下的催化活力。以酶反應的最大初速度的倒數對底物濃度的倒數作圖，以Lineweaver-Burk雙倒數作圖，可以判斷熊果酸對胰脂肪酶的抑制作用類型，并求得抑制常數Ki。

1.2.3 熒光分光光度法測定熊果酸對胰脂肪酶的表面疏水性的影響 胰脂肪酶和疏水性熒光探針ANS在37℃，相同的緩沖體系中混合30 min后，激發波長390 nm，400～600 nm掃描，測定不同濃度的熊果酸存在下對ANS-胰脂肪酶體系的熒光光譜的影響。

1.3 數據分析

熊果酸對胰脂肪酶抑制活性和抑制動力學實驗進行3次重復實驗(n=3)，并采用SPSS13.0統計軟件進行數據偏差分析處理，結果以x±s表示。

2 結果與討論

2.1 熊果酸對胰脂肪酶的抑制活性

圖2顯示，隨著熊果酸濃度的增加(0～5.0 mg/mL)，抑制率在不斷升高，但之后隨熊果酸的濃度的不斷增加，其對胰脂肪酶的抑制能力趨于平緩，當達到10 mg/mL時抑制率基本上趨于穩定，這表明熊果酸對胰脂肪酶的抑制作用是具有濃度依賴性;進一步解析其半數抑制濃度(IC50)為1.87±0.05 mg/mL，這意味著熊果酸對胰脂肪酶有一定的抑制活性。

圖2 熊果酸對胰脂肪酶的抑制作用

2.2 熊果酸對胰脂肪酶的抑制時間進程的測定

在相同的緩沖體系下，每隔180 s從不同濃度的熊果酸－胰脂肪酶中取出相同體積的孵化液后，加入底物，測定胰脂肪酶的失活的時間進程。由圖3可以看出，在不同的熊果酸濃度下，隨著孵化時間的增加對胰脂肪酶的抑制率沒有發生變化，這表明熊果酸可能會輕松的與胰脂肪酶發生結合，并快速的改變酶的生理結構和性質，最終使酶在短時間內得到抑制，且相對活性不再隨著孵化時間發生變化[7，8]。

圖3 熊果酸對胰脂肪酶的抑制時間進程

2.3 熊果酸對胰脂肪酶抑制動力學研究

通過Lineweaver-Burk雙倒數方程作圖，在固定抑制劑濃度時，1/ν對1/[S]作圖可得一直線，根據不同濃度抑制劑下，不同直線在坐標軸上的相交情況判斷抑制類型。圖4可以看出，隨著抑制劑濃度的增大，直線斜率不斷增大，并且是相交于縱坐標的一點，得到酶催化反應的動力學參數表觀米氏常數(Kmapp)逐漸增大，最大反應速率(Vmax)保持不變，這是典型的競爭性抑制作用類型[9]。其動力學方程的雙倒數方程為(2)，二級曲線可由方程(3)得到;

這表明熊果酸可能會結合到胰脂肪酶的活性中心區域并與周圍的氨基酸殘基發生相互作用，會導致與底物競爭活性位點，且誘導酶的結構發生變化，最終使酶自身的催化活性降低。在此基礎上，通過二級曲線方程(3)，求得抑制常數Ki=0.68 ±0.03 mg/mL。

圖4 熊果酸抑制胰脂肪酶的Lineweaver-Burk曲線

2.4 熊果酸對胰脂肪酶表面疏水性的影響

進一步探討熊果酸對胰脂肪酶的抑制機理，初步測定了熊果酸對胰脂肪酶表面疏水性的影響，圖5顯示隨著熊果酸濃度的不斷增加，ANS-binding熒光強度不斷增大，由101.4增加到226.3，這意味著熊果酸能夠明顯的增加胰脂肪酶的表面疏水性[10]，使更多的ANS結合到酪氨酸酶的疏水性區域;當熊果酸加入濃度大于5 mg/mL時，最大ANS-binding熒光強度的增加趨于平緩，這和酶抑制測定結果是正相關的(圖2)，這表明熊果酸對胰脂肪酶表面疏水性的增強也存在濃度依賴關系，這可能是由于胰脂肪酶疏水性的增加會使自身的酶活降低，并且使接近于胰脂肪酶活性位點的內部疏水性區域暴露出來，誘發了胰脂肪酶的解折疊[11]，這可能是熊果酸抑制胰脂肪酶活性降低的機理。

圖5 熊果酸對ANS-胰脂肪酶熒光的影響

3 結論

紫外分光光度法測定結果表明，熊果酸是一種競爭型的胰脂肪酶的抑制劑(半抑制率IC50為1.87 ±0.05 mg/mL，抑制常數Ki為 0.68 ±0.03 mg/mL);具有一定的胰脂肪酶抑制作用，且失活動力學時間進程能夠證明熊果酸能很快的與胰脂肪酶發生作用并迅速降低酶的活性;熒光光譜分析表明，隨著熊果酸濃度的增加，胰脂肪酶的表面疏水性逐漸增加，這意味著熊果酸能夠誘導胰脂肪酶活性位點內部疏水性區域暴露，不利于胰脂肪酶催化活性的發揮。

[1] 霍軍生.營養學[M].北京:中國林業出版社，2008:19－20.

[2] Klein S.Long-term pharmacotherapy for obesity[J].Obes Res，2004，12(12):163 －166.

[3] 夏龍鳳，張卓勇，楊瑞萍，等.降脂中藥研究進展[J].中華醫學研究雜志，2006，6(5):536 －539.

[4] 熊斌，雷志勇，陳虹.熊果酸藥理學的研究進展[J].國外醫學藥學分冊，2004，31(3):133 －136.

[5] 黃錫榮，張文娟，宋少芳，等.分光光度法測定微乳液中脂肪酶的酶活[J].化學通報，2001(10):659－661.

[6] 高貴，韓四平，王智，等.脂肪酶活力檢測方法的比較[J].藥物生物技術，2002，9(5):281 －284.

[7] Yin S J，Si Y X，Chen Y F，et al.Mixed-type inhibition of tyrosinase from agaricus bisporus by terephthalic acid:computational simulations and kinetics[J].The Protein Journal，2011，30(4):273 －280.

[8] Yin S J，Si Y X，Park D，et al.Tyrosinase inhibition by isophthalic acid:Kinetics and computational simulation[J].International Journal of Biological Macromolecules，2011，48(4):700 －704.

[9] Lu Z R，Shi L，Wang J，et al.The effect of trifluoroethanol on tyrosinase activity and conformation:inhibition kinetics and computational simulations[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，160(7):1896－1908.

[10] Qiu L，Chen Q H，Zhang J X，et al.Inhibitory effects of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid on the activity of mushroom tyrosinase[J].Food Chem，2009，112:609－613.

[11] Si Y X，Wang Z J，Daeui Park，et al.Effect of hesperetin on tyrosinase:Inhibition kinetics integrated computational simulation study[J].International Journal of Biological Macromolecules，2012，50(1):257 －262.