從粘細菌中尋找活性物質的研究方案

崔道林 陳春麗

【摘要】本文介紹了尋找生物活性物質的必要性和緊迫性，從粘細菌中尋找生物活性物質的優(yōu)點，具體探討了研究粘細菌活性物質的技術路線。

【關鍵詞】粘細菌生物活性物質

【中圖分類號】G64 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089（2014）03-0033-01

隨著環(huán)境污染的加劇和人類生活方式的變化，心腦血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病、老年性癡呆癥等疾病日益嚴重地威脅著人類健康，僅病毒病平均每年就新增2－3種。長久以來抗菌素被認為是治療傳染性疾病的神奇藥物，然而近年來抗菌藥物正在逐步喪失其神奇療效。隨著抗菌類藥物的廣泛使用，越來越多的病原菌產(chǎn)生了對一種甚至多種抗菌素的耐藥性[1]。人類迫切需要尋找新的、特效的藥物來治療這些疾病。人們都紛紛把目光投向了生物活性物質，所謂生物活性物質，是指來自生物體內的對生命現(xiàn)象具有影響的微量或少量物質，主要包括藥用物質、生物信息物質、毒素等生物體內的天然產(chǎn)物。此外，人們還希望利用生物活性物質開發(fā)出增進健康、預防疾病的營養(yǎng)食品、保健食品，有些生物活性物質還可用于化妝品中，有的可制成特殊的生物功能材料，使得生物活性活性物質成了研究熱點。已經(jīng)被人類開發(fā)的微生物資源如小單孢菌、放線菌和粘細菌等，在粘細菌中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質的數(shù)量，僅次于放線菌，真菌和芽孢桿菌，而且從放線菌等微生物中篩選新生物活性物質的重復幾率越來越高，而粘細菌在這方面具有獨特的優(yōu)勢。就目前情況看，粘細菌中55%的菌株可產(chǎn)生生物活性物質，而溶纖維素群粘細菌甚至高達95%。這為新結構或新作用機制生物活性物質的篩選提供了很好的一類微生物資源。

1.粘細菌產(chǎn)生生物活性物質的優(yōu)點

從已有的文獻看，粘細菌產(chǎn)生的生物活性物質主要表現(xiàn)以下幾個方面的特點：①種類多。包括芳香族、雜環(huán)類、醌類、大環(huán)類、聚醚類、多烯類、肽類化合物等，這一點與放線菌十分相似。1994 年Schummer 等人還分離到一種含硼生物活性物質。②結構新。目前分離到的60 多種基本結構中，僅有3 種是在其他微生物中報道過的。③一株菌可以產(chǎn)生一種基本結構的許多衍生物。例如， Sorangiumcell ulosum Soce 26 可產(chǎn)生50 多種soraphen 的衍生物；Myxococcus fulvus 產(chǎn)生的有35 種不同衍生物。④菌株特異性，而不是種或屬特異性。目前粘細菌分類上已確定的僅有12個屬約40個種，但包含許多菌株。同種的不同菌株產(chǎn)生生物活性物質的差異很大。另一方面，某些生物活性物質的產(chǎn)生菌的分布可跨越種、屬、甚至科的界限。⑤不同類別的多種生物活性物質可由一個菌株同時產(chǎn)生。⑥粘細菌生物活性物質有許多是作用于真核細胞的，這一點在生物活性物質產(chǎn)生菌中是比較特別的。

2.研究粘細菌活性物質的技術路線

2.1粘細菌的分離

綜合文獻中的方法，用玻棒平整的一頭印土樣，然后轉印在濾紙水瓊脂平板的濾紙上，將接好土樣的平板倒置放于30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)。7d左右就可在土樣周圍觀察到粘狀物。將粘狀物轉接到濾紙水瓊脂平板的濾紙上培養(yǎng)。3d后，轉接到濾紙上的粘狀物有明顯的擴展，變厚。約7～10d后，可觀察到子實體出現(xiàn)。

2.2粘細菌的液體培養(yǎng)與發(fā)酵產(chǎn)物的提取

從菌種的平板上挑出子實體接種到液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)3d作為種子液。以10 %的接種量接種到液體培養(yǎng)基，于30℃，160 rpm 培養(yǎng)2 d ，然后加入2 %(v/v) 高溫滅菌后的SIPI28非極性大孔吸附樹脂，繼續(xù)在搖床中培養(yǎng)5d。

2.3發(fā)酵產(chǎn)物粗提取物的薄層層析分離

粗提物的分離采用硅膠薄層層析。層析板用薄層層析硅膠H(60 型) 制備，采用展層液(石油醚:丙酮=3:1)上行法展層。層析后，在紫外燈下觀察。將點刮下，用甲醇洗脫。10000rpm離心，收集上清，揮發(fā)甲醇，得到分離物。

2.4進行ESL-MS分析

電噴霧質譜(ESI-MS)已發(fā)展成為一種通用的質譜技術，它是通過測定樣品離子的質荷比(m/z)來進行成分和結構分析的方法，ESI-MS從一開始就成為了藥學和生物醫(yī)學研究領域重要的標志性工具，廣泛地使用在組合化合物庫的高通量篩選、雜質分析、藥代動力學研究和代謝產(chǎn)物的確認，以及蛋白質結構特征的表達等各方面應用領域。

2.5抗菌譜測定

將通過薄層層析得到的分離物，用二甲亞砜溶解，將已滅菌的濾紙片放入浸泡1h ，取出后晾干備用。接著將各種待測菌或孢子懸液分別接種0.5mL 涂布平板，然后將濾紙片分別放在培養(yǎng)基表面，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

粘細菌中令人感興趣的是其基因組遠較一般的細菌基因組大，約9454～10010 kb。大量的基因被“奢侈”地用來合成許多復雜的次級代謝產(chǎn)物對其自身的意義似乎是長期進化選擇的結果。豐富次級代謝產(chǎn)物的合成作為粘細菌生長后期的主要細胞活動之一，與粘細菌細胞形態(tài)的發(fā)生有著密切的關系。有關工作的開展不但在資源利用方面具有重要意義，在理解生物進化等生命本質問題也有重要意義。

參考文獻：

[1]Levy, S.B, Antibiotic resistance-the problem intensifies. Adv Drug Deliv Rev, 2005. 57(10): p. 1446-50.