生長曲線法檢測復(fù)方大果木姜子軟膠囊的抗腫瘤作用

胡萬福 楊燕

生長曲線法檢測復(fù)方大果木姜子軟膠囊的抗腫瘤作用

胡萬福 楊燕

目的 研究復(fù)方大果木姜子軟膠囊對腫瘤細(xì)胞Hep-2的拮抗作用。 方法 臺盼藍(lán)染色法及生長曲線法。結(jié)果 通過觀察藥物作用于細(xì)胞后對其正常生長曲線的影響, 發(fā)現(xiàn)藥物作用于 Hep-2細(xì)胞后, 明顯延長細(xì)胞正常生長的倍增時(TD2=3.245)從而抑制Hep-2的正常生長。 結(jié)論 復(fù)方大果木姜子軟膠囊對腫瘤細(xì)胞Hep-2的生長具有明顯的抑制作用。

復(fù)方大果木姜子軟膠囊；臺盼藍(lán)染色；生長曲線；抗腫瘤作用

通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性, 細(xì)胞即可被認(rèn)為已經(jīng)死亡。臺盼藍(lán)(Trypan Blue)是檢測細(xì)胞膜完整性最常用的生物染色試劑。正常細(xì)胞能夠排斥臺盼藍(lán), 而死亡的細(xì)胞由于細(xì)胞膜的完整性喪失, 通透性增加, 細(xì)胞可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色［1］。依據(jù)此原理, 細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色后, 可通過顯微鏡,直接鏡下計數(shù)或拍照后計數(shù), 實現(xiàn)對細(xì)胞存活率比較精確的定量分析?；谶@一原理, 本文通過此方法證明復(fù)方大果木姜子軟膠囊對腫瘤細(xì)胞Hep-2的生長具有明顯的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng) Hep-2 細(xì)胞(貴陽醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞中心提供)、在5%CO2, 37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng), 用含10%新生牛血清、青霉素(100 μg/ml), 鏈霉素(100 μg/ml)的RMPI1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng), 實驗用細(xì)胞選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.1.2主要藥品與試劑 復(fù)方大果木姜子軟膠囊(貴陽中醫(yī)學(xué)院制劑教研室提供)、喜樹堿(武漢李時珍藥業(yè)有限公司,批號：20120401)RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品)、新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)、DMSO為Sigma公司產(chǎn)品, 其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1實驗用復(fù)方大果木姜子內(nèi)容物的處理及給藥濃度的確定 在保證用藥劑量的前提下, 將藥物制備為固體分散體,從而方便藥物與細(xì)胞充分作用, 制備前后測定主要藥物含量達(dá)到67.8%。臨用前, 用含2%新生牛血清RMPI1640培養(yǎng)基稀釋藥物, 起始給藥濃度為100 μg/ml；采用臺盼藍(lán)染色方法, 首先以100、10、1 μg/ml三個濃度進(jìn)行藥物初篩［2］, 根據(jù)初期實驗結(jié)果, 確定以10 μg/ml為主進(jìn)行藥物作用后活細(xì)胞率(EC50, EC50=未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)值測定。設(shè)復(fù)方組、陽性組與空白組, 給藥濃度(單位μg/ml)依次為16、8、4、2、1, 可以求得Hep-2作用于各組的EC50值分別為復(fù)方組7.382 μg/ml；對照組3.89 μg/ml。各給藥濃度下細(xì)胞計數(shù)結(jié)果見表1。

表1 不同濃度下(單位μg/ml)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果(n×104)及活細(xì)胞率(%)

1.2.2實驗用細(xì)胞株的培養(yǎng) 根據(jù)Hep-2細(xì)胞株的生長特性, 取其復(fù)蘇, 在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)(飽和濕環(huán)境)培養(yǎng), 培養(yǎng)基為含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基, 換液采取全換液方式進(jìn)行, 洗液為Hank’s液待細(xì)胞長滿后傳代。

1.2.3實驗過程 取處于對數(shù)生長期的Hep-2, 用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制為1×104/ml的細(xì)胞懸液, 在25 ml培養(yǎng)瓶中接種5 ml, 共接種21瓶, 分為正常組、藥物組與陽性對照組(每組7瓶), 分別加入終濃度為EC50的受試藥物與對照藥物, 在給藥2 h, 1、2、3、4、5、7 d時分別取樣40 μl(取樣時先用2.5%的胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞充分消化), 加入0.4%的臺盼藍(lán)試劑10 μl染色后, 在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù), 以每天細(xì)胞計數(shù)結(jié)果的對數(shù)為縱軸, 以時間為橫軸繪制細(xì)胞生長曲線, 對比觀察藥物對各實驗細(xì)胞的生長抑制作用, 結(jié)果見表2及繪制的各實驗組在不同實驗條件下的細(xì)胞生長抑制曲線圖, 見圖1。

表2 藥物作用于腫瘤細(xì)胞Hep-2后的不同時間細(xì)胞計數(shù)結(jié)果(n×104)

圖1 藥物對Hep-2細(xì)胞的生長抑制曲線

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。各實驗組間比較和不同濃度條件下比較均采用齊性方差t檢驗, P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果及分析

依據(jù)藥物作用于細(xì)胞倍增時(TD)公式：TD=0.301 t/(logNtlogNo)(t：培養(yǎng)時間, No：首次記下的細(xì)胞數(shù), Nt：t時間后的細(xì)胞數(shù))可以求得：空白組TD1=1.081；藥物組TD2=3.245；對照組TD3=2.361。

通過上述數(shù)據(jù)分析可知：與空白組細(xì)胞正常倍增時(TD1=1.081)比較, 復(fù)方組作用于Hep-2細(xì)胞后可以明顯的延長細(xì)胞的倍增時(TD2=3.245), 且作用強于對照組(TD3=2.361)；同時, 結(jié)果表明, 復(fù)方對Hep-2細(xì)胞的抑制作用是通過影響Hep-2細(xì)胞的正常生長周期而發(fā)揮作用。

藥物對Hep-2細(xì)胞生長飽和密度的影響(NS)：從細(xì)胞生長抑制圖中可以看出, 藥物作用于Hep-2細(xì)胞后, 明顯影響其正常生長, 細(xì)胞生長飽和密度顯著降低, 與正常組細(xì)胞比較, 細(xì)胞生長達(dá)大坪期的時間與細(xì)胞數(shù)目顯著降低, 但作用與喜樹堿相比略差。

3 討論

腫瘤已逐漸成為人類重大殺手之一。而中藥復(fù)方抗腫瘤研究則是開發(fā)抗癌中藥制劑研究的一個重要領(lǐng)域。但是如何在眾多的單味中藥中尋找出有效的抗癌藥物呢？因此對中藥抗腫瘤的篩選是其中的研究重點［3-5］。本研究立足于單味中藥已有的現(xiàn)代藥理研究成果, 結(jié)合傳統(tǒng)中藥復(fù)方配伍理論,深入挖掘民族醫(yī)藥精髓, 對研制開發(fā)的復(fù)方大果木姜子軟膠囊進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞研究。這些實驗研究, 為進(jìn)一步中藥復(fù)方的體外抗腫瘤研究提供了實驗依據(jù)。

本研究以Hep-2細(xì)胞株為篩選模型, 采用體外抑制腫瘤增殖的方法, 對復(fù)方大果木姜子軟膠囊的藥物有效部位采用臺盼藍(lán)染色法結(jié)合細(xì)胞生長曲線繪制從而直觀的表明實驗藥物對Hep-2的生長抑制作用。

綜上所述, 復(fù)方大果木姜子軟膠囊對腫瘤細(xì)胞Hep-2的正常生長增殖具有明顯的抑制作用, 進(jìn)一步為該復(fù)方制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。同時結(jié)合實驗用藥物提取部位可知：脂溶性成分是其抗腫瘤作用的主要部位, 但對其中的抗腫瘤活性具體成分有待進(jìn)一步研究。

［1］ 張卓然.實用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社, 1999: 198.

［2］ 黃禎祥.醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實驗技術(shù).北京：科學(xué)出版社, 1990:661~693.

［3］ 吳劍, 滕國英.中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展 .國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報, 2007, 13(8):114-117.

［4］ 林建軍, 曾金雄, 戴西湖.抗肝癌中藥的生物學(xué)效應(yīng)研究進(jìn)展.中醫(yī)藥通報, 2005, 4(6):62.

［5］ 張艷瓊, 黃利鳴, 吳江峰, 等.天花粉蛋白對荷瘤小鼠抑瘤作用的實驗研究.時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(10):2389-2390.

Anti-tumor effect of compound fructus litsea pungens soft capsule tested by growth curve method

HU Wan-fu, YANG Yan.
First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China

ObjectiveTo study the antagonism of compound fructus litsea pungens soft capsule on tumour cell Hep-2.MethodsTrypan blue and growth curve methods were applied.ResultsObservation of the influence of the drug on the normal growth curve of cell showed that the drug inhibited growth of cells by prolonging the normal growth multiplication (TD2=3.245).ConclusionCompound fructus litsea pungens soft capsule has obvious inhibiting effect on tumour cell Hep-2.

Compound fructus litsea pungens soft capsule; Trypan blue; Growth curve ; Antitumor effect

2014-05-13］

550002 貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(胡萬福)；貴陽醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞中心(楊燕)