HPLC－ELSD法測定頸腦康丸中黃芪甲苷的含量

周修森 方永凱

河南省信陽市食品藥品檢驗所，河南 信陽 464000

頸腦康丸為河南省信陽市中醫院制劑室配制的口服制劑，由黃芪、雞血藤、丹參、地龍、葛根、威靈仙、紅花等十三味中藥組成。具有益氣活血，痛經活絡的功效，臨床用于治療頸椎病、腦梗塞、腦血管病后遺癥及血管性腦供血不足等。該制劑中黃芪為君藥，本文以黃芪甲苷為指標成分，參考有關文獻［1－5］，建立高效液相色譜－蒸發光散射檢測 (HPLC－ELSD)法測定方中黃芪甲苷含量的方法，為該制劑的質量控制和評價提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 1525高效液相色譜儀、Waters 2420 ELS檢測器、Waters 2707自動進樣器 (美國 Waters公司);METTLER AE－240電子分析天平 (梅特勒－托利多儀器有限公司);KQ－300型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);基因型1850D超純水機 (重慶摩爾制水設備有限公司)。

1.2 材料 頸腦康丸 (河南省信陽市中醫院制劑室，批號:20130518，20130611，20130706);黃芪甲苷對照品(批號:110781－200613，中國藥品生物制品檢定所);色譜純乙腈 (河北四友卓越科技有限公司，批號:130615);水為自制純化水;其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 反相高效液相色譜－蒸發光散射檢測器檢測，流動相為乙腈－水 (36∶64)，色譜柱為Agilent HCC18 Analytical(5μm，4.6mm ×250mm)，流速為 1.0 ml·min－1，漂移管溫度為70℃，氮氣流量為2.8L·min－1，柱溫為25℃，進樣體積為10μL，理論板數按黃芪甲苷峰計應不低于4000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h以上的黃芪甲苷對照品16.05mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(含黃芪甲苷 0.1605mg·ml－1)。

2.2.2 樣品溶液［2－3］取本品10g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50ml，超聲40min(功率300W，頻率50kHz)，過濾，濾渣用甲醇洗滌2次 (每次10ml)，洗液并入濾液，濾液濃縮至干，殘渣加水15ml，微熱使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂 (內徑1.5cm，柱高12cm)，依次用水100ml、1%氫氧化鈉100ml、水200ml、30%乙醇100ml洗滌，棄去洗滌液，再用95%乙醇150ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例和工藝制備不含黃芪的空白制劑樣品，按2.2.2項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取對照品溶液、樣品溶液和陰性對照溶液，按“2.1項”下色譜條件實驗，結果:樣品溶液與對照品溶液一致，均在15.4min處出現黃芪甲苷峰，而陰性對照溶液在該位置處并沒有峰出現，說明用本法處理樣品制備供試液不產生假陽性干擾。色譜圖見圖1。

2.3.2 線性關系 在制備黃芪甲苷對照品溶液時，同時配制濃度為0.032、0.08、0.16、0.24、0.32mg·ml－1的系列對照品溶液，分別按2.1項下色譜條件測定，以對照品溶液濃度的對數為縱坐標，峰面積值的對數為橫坐標進行回歸，線性回歸方程為:y=0.6615x－3.9805(r=0.9999)。表明黃芪甲苷在0.032～0.32 mg·ml－1的范圍內線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.1項”下配制的對照品溶液，重復進樣5次，測得黃芪甲苷峰面積的平均值為63917，RSD=0.92%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一制備樣品溶液 (批號20130518)，分別在0、1、3、5、8h進樣測定，測得峰面積的RSD=1.16%(n=5)，表明樣品溶液在8h內丹參素含量穩定。

2.3.5 重復性試驗 取同批次樣品 (批號20130518)，按“2.2.2項”下方法制備6份樣品溶液，按“2.1項”下色譜條件分別測定，結果該批樣品每10g中含黃芪甲苷的平均值為0.9129mg，RSD=1.71%(n=6)，表明所用方法重復性好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知準確含量的樣品 (批號20130518)5g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50ml，再精密加入對照品溶液2.5ml，按“2.2.2項”下方法，平行制備6份供試液，依“2.1項”下色譜條件測定，計算加樣回收率 (%)，結果見表1。試驗結果表明，所采用的測定方法準確度高。

表1 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.4 樣品含量測定 取頸腦康丸3批，分別按“2.2.2項”下方法制備樣品溶液，每批平行做3份，依“2.1項”下方法測定，計算出每10g中黃芪甲苷的平均含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 樣品溶液的制備 采用超聲提取和柱洗脫純化分離的方法制備樣品溶液。超聲提取技術利用高頻電磁波穿透提取介質，到達物料內部維管束和細胞，產生的電磁場還可加速被提取成分向提取溶劑界面擴散，最大限度保證提取的質量［2］;提取液過濾后，通過D101樹脂柱，經水、堿水、稀醇溶液洗滌純化，乙醇洗脫，蒸干，甲醇溶解成供試品溶液。該方法提取效率高，操作簡便，重現性好，避免了回流提取、水飽和正丁醇萃取分離的繁瑣操作，縮短了檢驗流程，提高了工作效率，節省了人力物力。

3.2 檢測方法的選擇 黃芪甲苷在紫外光區屬于末端吸收，吸收波長與所用溶劑甲醇的截止使用波長相近，受溶劑及其組分的影響，可靠性和靈敏度較低。參照中國藥典2010年版一部［5］，采用通用性檢測器－蒸發光散射檢測器進行檢測。

3.3 含量限度的確定 黃芪甲苷 (即黃芪苷IV)為羊毛酯醇形的四環三萜皂苷，是中藥黃芪的主要活性成分，在復方制劑中以黃芪為君藥測定其黃芪甲苷含量作為質量評價指標是合理可行的;根據實驗結果和處方中用量，擬定本品每10g含黃芪以黃芪甲苷 (C41H68O14)計，不得少于0.8mg。

［1］趙建邦，馬瀟．HPLC－ELSD測定補肺丸中黃芪甲苷的含量［J］．中國實驗方劑學雜志，2010，16(14):89－90．

［2］李莉，譚蔚，馬雪松．微波輔助提取黃芪甲苷的研究［J］．中藥材，2007，30(2):234－236．

［3］邢婕，秦雪梅，張麗增．HPLC－ELSD法測定黃芪甲苷含量供試品溶液制備方法改進［J］．山西大學學報 (自然科學版)，2008，31(4):577－579．

［4］周修森，方永凱．HPLC法測定柴丹疏利膠囊中丹參素的含量［J］．西部中醫藥，2012，25(10):25－27．

［5］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典 (一部)［M］．北京:中國醫藥出版社，2010:549．