維生素B12的復(fù)方產(chǎn)品含量檢測的研究

趙宇 劉程城

【文章摘要】

本文研究了高效液相法檢測維生素B12的復(fù)方產(chǎn)品的含量。檢測方法是色譜柱是COSMOSILC18；流動相是甲醇-0.05mol/L磷酸鹽緩沖液；流速為1.2mL/min；柱溫是室溫；進(jìn)樣量是20μL；檢測波長是360nm。試驗(yàn)結(jié)果表明該方法適用于檢測維生素的復(fù)方產(chǎn)品中維生素B12的含量。

【關(guān)鍵詞】

HPLC；維生素B12；檢測

0 引言

高效液相色譜法（HPLC）也可以稱作高速液相色譜、高壓液相色譜等。它是色譜法的一個非常重要的分支，此種方法的流動相為液體，輸液系統(tǒng)采用高壓灌輸，將流動相輸入色譜柱內(nèi)，流動相的液體為單一溶劑或按照比例混合的混合溶劑、緩沖液等。在色譜柱內(nèi)各種成分被分離，然后進(jìn)入檢測器檢測，得到待測樣品的成分含量。這種 檢測方法在醫(yī)學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用十分普遍。

維生素也被稱為“萬年青”產(chǎn)品，它的市場的應(yīng)用前景非常廣闊。復(fù)方維生素產(chǎn)品是一種處方藥，它在國內(nèi)外的應(yīng)用已經(jīng)非常普遍，它的主要成分是維生素B12、維生素B6及葉酸。近年來，采用高效液相色譜法也就是HPLC法，測定維生素B12的單體含量已經(jīng)被國、內(nèi)報到，但是對于采用HPLC法測定維生素復(fù)方產(chǎn)品的報道還非常少。本文建立的HPLC法可測定維生素復(fù)方成品中維生素B12的含量，方法簡單、不受葉酸等成分的干擾，測定結(jié)果準(zhǔn)確。

1 儀器與試藥

1.1儀器

LC-10ATvp高效液相色譜儀（N2000色譜工作站、7725i六通進(jìn)樣閥、SPC-10Avp紫外檢測器）；電子天平；pH計(jì)；UV-260型紫外分光光度計(jì)。

1.2試藥

維生素B12對照品（含量為99.8%）；復(fù)方維生素膠囊（根據(jù)處方比例自制）甲醇為色譜純，其它所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

本試驗(yàn)采用的色譜柱是COSMOSILC18，其規(guī)格為250mm×4.6mm×5μm；流動相是甲醇-0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（22：78，pH為6.4）；流速為1.2mL/min；柱溫是室溫；進(jìn)樣量是20μL；檢測波長是360nm。

2.2測定法

取樣品內(nèi)容物，準(zhǔn)確稱取5份，每份的質(zhì)量精確為0.1g，用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH= 6.4）溶解并定量轉(zhuǎn)移至50 ml棕色溶量瓶中，加磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，超聲溶解20min，過濾后取上清液即得制備的樣品。精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取維生素B12按照上述制得待測樣品，相同方法測定。對照品是按處方比例制備的不含維生素B12的樣品，對照樣品溶液制備的過程和上述方法相同。進(jìn)樣5次，待測樣品溶液、維生素B12溶液及對照樣品的溶液色譜圖如圖1所示。圖A維生素B12溶液、圖B待測樣品溶液、圖C對照品溶液。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取上述待測樣品溶液、維生素B12溶液、對照樣品溶液溶液各20μL，按照色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜，詳見圖1。理論塔板數(shù)按維生素B12計(jì)算不低于2000。由圖1可知，維生素B12保留時間約為715min，維生素B6及葉酸等無干擾。

2.4線性分析試驗(yàn)

用分析天平準(zhǔn)確稱取對照品維生素B12適量，加入流動相制成濃度是10.2μg/mL維生素B12對照品溶液。準(zhǔn)確移取該溶液1、5、10、15、20ml，分別放入100mL棕色容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，然后混勻，制備得到不同濃度的維生素B12溶液。上述溶液分別取20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。橫坐標(biāo)是峰面積積分值（X），縱坐標(biāo)是維生素B12進(jìn)樣量（Y）作圖，得到線性回歸方程Y=38647.1X+368.5，r=0.9999。結(jié)果表明，維生素B12進(jìn)樣量在10.0μg-202. 00μg之間，峰面積積分值和進(jìn)樣量的線性關(guān)系良好。

2.5進(jìn)樣的精密度試驗(yàn)

將不含維生素B12對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，維生素B12峰面積變化的RSD=1.2%。

2.6樣品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備好供試品溶液溶液之后，分別在制備的第0、2、6、8 h進(jìn)行取樣測定，測得的結(jié)果，維生素B12含量變化的RSD=0.29%。

2.7樣品回收試驗(yàn)

按照處方的各成分比例制備維生素B12標(biāo)示量為80%、100%和120%的復(fù)方樣品，根據(jù)樣品溶液的制備方法，制備不同濃度的維生素B12溶液，根據(jù)色譜條件進(jìn)行測定，平均回收率為99.7%； RSD=1.81% （n=9）。

2.8待測樣品含量測定

樣品的含量測定根據(jù)2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行，3批樣品的含量測定結(jié)果分別為93.7%、90.6%、96.2%。

3 討論

根據(jù)以往的研究成果，維生素B12的吸收波長的范圍在190nm-600nm，它的最大吸收波長是360nm。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，維生素B12的含量測定波長為360nm。同時，因?yàn)榫S生素B12具有見光易分解的特性，所以，在試驗(yàn)的檢測過程中要注意避光。

由于維生素復(fù)方成品中中除了含有維生素B12以外，還含有葉酸、維生素B6、淀粉等成分，這些成分都會對維生素B12的溶出造成影響。所以為了保證試驗(yàn)結(jié)果精確性，樣品采用超聲法進(jìn)行處理，增大維生素B12的溶解度。

根據(jù)試驗(yàn)可知，流動相pH值的變化對維生素B12的保留時間影響不大，但是流動相中甲醇和磷酸二氫鉀緩沖液的比例變化顯著影響維生素B12的保留時間。所以，要在試驗(yàn)過程中選擇甲醇和磷酸二氫鉀緩沖液的最佳比例。

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【作者簡介】

趙宇，女，1977年7月24日，遼寧錦溪市人，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：生物技術(shù)。