甲狀旁腺素對人甲狀腺髓樣癌細胞增殖和凋亡的影響

馬世紅+劉勤江+田尤新+陳瑞慧

[摘要] 目的 探討甲狀旁腺素對人甲狀腺髓樣癌細胞體外增殖抑制及凋亡作用。 方法 體外培養(yǎng)甲狀腺髓樣癌細胞株，經(jīng)甲狀旁腺素和甲狀旁腺素受體單抗干預(yù)處理后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況，流式細胞儀檢測細胞凋亡。結(jié)果 倒置相差顯微鏡下細胞變化明顯，各濃度的甲狀旁腺素和甲狀旁腺素受體單抗均分別能有效地抑制甲狀腺髓樣癌細胞增殖、誘導細胞凋亡，凋亡作用呈時間和濃度依賴。當甲狀旁腺素濃度為2.0μmol/L、甲狀旁腺素受體單抗?jié)舛葹?.0μmol/L時，對細胞凋亡作用顯著（P<0.05），凋亡率分別為13.24%及20.78%。 結(jié)論 甲狀旁腺素對人甲狀腺髓樣癌細胞增殖有抑制作用并能誘導其凋亡。

[關(guān)鍵詞] 甲狀旁腺素；甲狀腺髓樣癌；凋亡

[中圖分類號] R736.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）05-29-04

甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）由甲狀旁腺分泌，它與降鈣素（calcitonin，CT）共同調(diào)節(jié)人體鈣磷代謝[1]。有報道甲狀旁腺素相關(guān)肽對腫瘤細胞有增殖作用[2-4]。本研究用人甲狀腺髓樣癌細胞株（TT細胞株）作為研究對象，分別給于PTH和甲狀旁腺素受體單抗（anti-parathyroid hormone receptor1 antibody，anti-PTHR1）干預(yù)處理，觀察TT細胞生長狀況，檢測細胞凋亡，研究PTH和anti-PTHR1對甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma ，MTC）細胞凋亡的影響作用，可望為MTC的治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

人甲狀腺髓樣癌TT細胞株（購于中國科學院上海細胞庫），胎牛血清（購自美國Sigma公司），F(xiàn)12k培養(yǎng)基（購自美國Gibco公司）。胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、四甲基耦氮唑鹽（MTT）、甲基亞砜（DMSO）及PTH均購自美國Sigma公司。anti-PTHR1（購自美國abcanm公司），流式細胞儀檢測盒（購自美國BD公司）。倒置相差顯微鏡（日本Olympas產(chǎn)品），流式細胞儀（美國BD公司產(chǎn)品）。其他常規(guī)設(shè)備由國內(nèi)生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和處理 人甲狀腺髓樣癌TT細胞株培養(yǎng)于37℃的F12K培養(yǎng)基中（含15%胎牛血清和500U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），常規(guī)消化傳代。對數(shù)生長期的TT細胞，以1×106/mL細胞濃度接種于一批25mL培養(yǎng)瓶中（2mL/瓶），24h后分組加入PTH及anti-PTHR1。PTH濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L；anti-PTHR1濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/L，24h后觀察細胞變化結(jié)果。

1.2.2 流式細胞儀檢測TT細胞凋亡 對數(shù)生長期的TT細胞消化傳代后設(shè)：（1）對照組（不加PTH及anti-PTHR1）；（2）PTH干預(yù)組；（3）anti-PTHR1干預(yù)組。PTH濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L；anti-PTHR1濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/L。48h后用PBS離心洗滌，棄去上清液。由專人按照說明書操作，最后將樣品置于冰上輕輕混勻，流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PTH及anti-PTHR1對TT細胞生長影響

光學顯微鏡下見對照組細胞呈單層，生長狀態(tài)良好，細胞透明且界限清楚。用PTH和anti-PTHR1處理24h后，隨著濃度增加、作用時間延長，細胞數(shù)量減少，細胞形態(tài)逐漸皺縮變圓與周圍的細胞分離，細胞體積縮小，培養(yǎng)液中見到許多碎片及顆粒。部分細胞核開始濃縮，核膜逐漸崩解，染色質(zhì)分割成塊狀等呈現(xiàn)出細胞凋亡的變化。

2.2 PTH及anti-PTHR1對TT細胞的凋亡作用

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，照組細胞無明顯變化（圖1）。經(jīng)PTH及anti-PTHR1處理TT細胞后，各濃度的PTH和anti-PTHR1均可引起TT細胞的凋亡。凋亡作用隨藥物濃度增加而加強、在相同濃度下凋亡作用隨時間延長而上升，呈時間和濃度依賴。凋亡率與濃度和時間均呈正相關(guān)（P<0.05）。當PTH濃度為2.0μmol/L時，對TT細胞的凋亡作用顯著，凋亡率13.24%（P<0.05）。見圖2；anti-PTHR1濃度為1.0μmol/L時，對TT細胞的凋亡作用顯著，凋亡率20.78%（P<0.05）。見圖3。

3 討論

甲狀腺癌目前的治療方法主要是外科手術(shù)、甲狀腺素內(nèi)分泌治療及131碘核素內(nèi)照射治療。甲狀腺髓樣癌（MTC）起源于濾泡旁細胞（C細胞），具有神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤的特性，降鈣素是其特殊的標志物[5-6]，手術(shù)切除仍是其首選的根治方式。

MTC與分化型甲狀腺癌不同，因起源于C細胞，不受促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）的影響，不表達鈉/碘轉(zhuǎn)運蛋白（sodium/iodide symporter，NIS）、也不攝碘，TSH抑制治療和I131核素內(nèi)照射治療無效[7]。MTC具有早期轉(zhuǎn)移的特性，約10%～15%的患者在初診時已有遠處轉(zhuǎn)移，很難通過手術(shù)而達到根治，手術(shù)治療后10年生存率遠低于分化型甲狀腺癌[8]。有關(guān)人甲狀腺髓樣癌細胞體外生長增值的研究報道較多[9-11]。各種生物免疫治療、分子靶向藥物、腫瘤疫苗、單克隆抗體、免疫基因等已經(jīng)在臨床前試驗中取得了一定的療效，部分藥物已經(jīng)開始臨床使用，但療效不理想[12-15]。因此，研究MTC的發(fā)生發(fā)展機制，闡明其發(fā)病機理并探索MTC新的治療途徑，尋找新的有效分子治療靶點，針對腫瘤細胞生長的某些主要環(huán)節(jié)，開發(fā)新的治療藥物，是目前甲狀腺癌研究領(lǐng)域的難點和熱點問題之一。endprint

甲狀旁腺素作為一種調(diào)節(jié)人體鈣磷代謝的內(nèi)分泌激素，是否參與MTC的發(fā)生發(fā)展及對MTC細胞生長和增殖存在影響，目前國內(nèi)外尚未見報道。有研究表明地塞米松能抑制甲狀腺髓樣癌TT細胞的增值，主要通過抑制細胞G1期而誘導凋亡[16]，另有報道蛋白激酶C在體外通過增加細胞凋亡而抑制甲狀腺髓樣癌細胞的擴散[17]。本研究對甲狀腺髓樣癌TT細胞給予PTH和anti-PTHR1兩種藥物干預(yù)，光鏡觀察結(jié)果顯示對照組TT細胞呈單層，梭形或多邊形貼壁生長，從細胞形態(tài)觀察，其生長狀態(tài)良好。TT細胞經(jīng)PTH和anti-PTHR1干預(yù)后，細胞變圓且比較凌亂，細胞質(zhì)固縮，細胞核質(zhì)比減小，顯示TT細胞生長及增殖活性均受到顯著抑制作用，部分細胞核開始濃縮、邊緣化，核膜逐漸崩解，染色質(zhì)分割成塊狀等變化，該變化反映了細胞的凋亡。其作用強度隨藥物濃度增加和作用時間延長而增加。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，不同濃度的PTH和anti-PTHR1均可引起TT細胞凋亡，差異有顯著性（P<0.05），凋亡率與濃度和時間均呈正相關(guān)（P<0.05）。當PTH濃度為2.0μmol/L、anti-PTHR1濃度為1.0μmol/L時，對TT細胞的凋亡作用最為顯著（P<0.05）。提示PTH和anti-PTHR1不但具有抑制TT細胞增值的作用，同時還可誘導其凋亡。可見，PTH對人甲狀腺髓樣癌TT細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的作用與對細胞誘導凋亡作用是一致的，說明PTH和anti-PTHR1具有抑制人甲狀腺髓樣癌TT細胞生長和誘導TT細胞凋亡雙重的生物學效應(yīng)。這將為今后進一步研究PTH對MTC的作用機制提供了理論依據(jù)和重要的參考。

綜上所述，本研究初步證實了PTH和anti-PTHR1對人甲狀腺髓樣癌細胞的抑制作用，能有效誘導人甲狀腺髓樣癌TT細胞的凋亡。深入探索其誘導凋亡機制，對于進一步研究PTH對人甲狀腺髓樣癌TT細胞的作用機制，具有非常重要的指導意義和實際應(yīng)用價值。隨著對PTH研究及認識的不斷深入，PTH和anti-PTHR1可能成為一種新的抗腫瘤治療靶點，為甲狀腺髓樣癌早期診斷及治療提供新的途徑。

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（收稿日期：2013-12-14）endprint

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