HU308對脂多糖誘導小膠質細胞分泌NO及IL—6的影響

趙建云+鄧展進+劉瑞珍

[摘要] 目的 研究大麻素CB2受體激動劑HU308對脂多糖（LPS）誘導小膠質細胞激活后NO及IL-6分泌的影響。 方法 體外培養小鼠小膠質細胞株（BV-2細胞），分為對照組、LPS刺激組及干預組（LPS+HU308）。通過顯微鏡觀察各組小膠質細胞的形態學變化，CCK-8法檢測各組小膠質細胞的增殖情況，Griess法檢測各組NO含量，ELISA法檢測各組IL-6水平。 結果 LPS刺激組的小膠質細胞中出現大量胞體增大，偽足粗短或消失的細胞和一些壞死細胞，細胞增殖較差，NO及IL-6表達水平顯著增高。經大麻素CB2受體激動劑HU308干預后，大部分細胞胞體稍大，偽足尚明顯，細胞破壞程度輕，增殖較好，炎性因子表達均明顯下降。 結論 激動小膠質細胞表面的大麻素CB2受體，可以減輕LPS造成的小膠質細胞過度活化或損傷，抑制其炎性因子N0及IL-6的分泌，從而達到中樞神經系統炎性損傷后的神經保護作用。

[關鍵詞] 大麻素CB2受體激動劑；HU308；脂多糖；小膠質細胞；NO；IL-6

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）05-36-04

腦血管病繼發腦損傷，炎癥反應起著重要作用[1]。小膠質細胞是中樞神經系統重要的免疫細胞，在腦內起著免疫監視和免疫防御功能[2]，并且對中樞神經系統有支持、營養、保護和修復等重要作用[3]。正常情況下，小膠質細胞處于相對靜息狀態，在中樞神經系統缺血、缺氧時可迅速被激活，大量分泌炎癥因子、一氧化氮（nitric oxide，NO）等分子，參與中樞神經損傷的病理發展過程[4]。因此，抑制小膠質細胞活化后的炎癥反應可以作為治療腦血管疾病腦損傷的重要途徑之一[5-6]。內源性大麻素系統神經保護作用成為當今研究的熱點問題。激動內源性大麻素受體（CB1＼CB2）可減輕動物模型局灶性腦缺血和全腦缺血造成的腦損傷[7]，但具體機制尚不明確。大麻素CB2受體在中樞神經系統主要表達在小膠質細胞[8]。本實驗預通過體外培養小膠質細胞；研究CB2受體激動劑HU308對脂多糖造成的小膠質細胞過度活化或損傷后炎癥因子NO、IL-6表達的影響；探討激動小膠質細胞表面的CB2受體，對小膠質細胞形態功能及炎癥反應的影響，為神經保護類藥物的研發提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

小鼠小膠質細胞（江陰康眾康民生物醫藥技術公司）；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技有限公司）；DMEM高糖培養基、胰蛋白酶、青鏈雙抗、脂多糖（博士德生物公司）；IL-6 ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒及Griess法NO檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；HU-308（Cayman Chemical，美國）。

1.2 細胞培養

小膠質細胞株BV2購于江陰康眾康民生物醫藥技術公司。培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液（含青霉素100 U/mL 和鏈霉素100mg/mL）中，在37℃、5%CO2 恒溫孵箱中培養，細胞呈單層貼壁生長，進行常規培養和傳代。當細胞密度達80%左右時收集細胞，細胞以4×104～5×104/孔接種于培養板。

1.3 實驗分組與處理

實驗分為正常對照組、LPS刺激組（LPS濃度為1?g/mL）、LPS聯合HU308干預組（LPS濃度1?g/mL，HU308濃度分別1?mol/L、5?mol/L、10?mol/L）。上述五組均干預12h。

1.4 鏡下觀察

倒置相差顯微鏡10×20倍鏡下觀察各組小膠質細胞的形態變化。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖

應用96孔細胞培養板檢測細胞增殖，每孔加入培養基200?L約10000個細胞，經實驗分組與干預12h后，各孔加入20?LCCK-8溶液，在細胞培養箱內繼續孵育2h后用酶標儀檢測，450nm測定各孔吸光度值。

1.6 Griess 法檢測NO的含量

按照說明書Griess 法檢測NO的含量。取各組細胞培養上清液50μL加入96孔平底酶標板中，每組設6個復孔，依次加入氨基苯磺酸、萘基乙二胺，室溫避光孵育10min，酶標儀540nm 波長讀取A值，再依據標準曲線計算出NO的含量（濃度）。

1.7 ELISA法檢測細胞培養上清IL-6含量

按照試劑盒說明書推薦方法測定。根據說明書要求配制標準品液、10×標本稀釋液及洗滌液。收集細胞培養上清液，96孔酶標板中每孔各加入標準品或待測樣品100μL，將反應板充分混勻后置37℃40min，用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干；每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50μL（空白除外），將反應板充分混勻后置37℃20min，同前洗板；每孔加酶標抗體工作液100μL。將反應板置37℃10min，同前洗板；每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應15min；每孔加入100μL終止液混勻；30min內用酶標儀在450nm處測吸光值。以標準品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/mL為橫坐標，OD值為縱坐標，使用軟件作圖，畫出標準曲線。計算出相應IL-6含量。

1.8 統計學分析

實驗數據應用SPSS16.0統計軟件分析。以（）表示統計數據，組間比較應用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察各組小膠質細胞的形態變化

正常對照組細胞體呈圓形或橢圓形，從胞體發出細長的突起，表面有許多小棘突，細胞密度較高；見圖1。LPS刺激組刺激小膠質細胞12h后觀察大量胞體增大，偽足粗短或消失，可見一些壞死細胞，細胞密度較低；見圖2。與LPS刺激組比較，LPS聯合HU308 10?mol/L干預組，干預12h后觀察大部分細胞胞體稍大，偽足尚明顯，細胞破壞程度輕，密度較高。見圖3。endprint

2.2 HU308對LPS誘導的小膠質細胞增殖的影響

表1值結果顯示，LPS刺激組細胞增殖較差，與正常對照組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。HU308不同濃度干預組細胞增殖較好，濃度為10?mol/L的HU308組細胞增殖最好，各組與LPS刺激組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。HU308對損傷的小膠質細胞有保護作用。

2.3 HU308對LPS誘導的小膠質細胞炎癥因子（NO、IL-6）分泌的影響

表1結果顯示，LPS刺激組的細胞培養液中NO及IL-6含量顯著升高，與正常對照組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。HU308不同濃度干預組細胞培養液中NO及IL-6含量明顯降低，濃度為10?mol/L的HU308組NO及IL-6含量降低最明顯，與LPS刺激組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。各組間兩兩比較差異均有統計學意義。HU308對損傷小膠質細胞NO及IL-6的分泌有抑制作用。

3 討論

小膠質細胞是中樞神經系統最重要的固有免疫細胞和主要效應細胞，一般認為，它來源于單核巨噬細胞系，生理條件下靜息狀態的小膠質細胞呈分枝狀，僅進行簡單的吞噬作用，清除代謝產物，其活性受神經元產生的抑制因子如CD200R、CX3CR1 等調控[9]。當中樞神經系統發生損傷后，小膠質細胞迅速活化，其形態呈阿米巴樣改變，具有抗原提呈、調理吞噬及分泌炎性因子的作用[10]。腦損傷、低氧、缺血以及神經系統退行性疾病（AD 和PD），常伴隨著腦內炎癥的出現。小膠質細胞激活經常被認為是神經元凋亡的前期標志[11]。活化后的小膠質細胞可通過釋放炎性因子等對神經元具有損傷作用[12]。

近些年對內源性大麻素系統（endocannabinoid system，ECS）的研究成為一個熱點。研究發現，ECS由內源性大麻素、大麻素受體及大麻素生物合成和降解的酶系組成。體內存在兩種大麻素受體，即CB1受體和CB2受體[13-14]。CB1受體主要分布在腦、脊髓及外周神經系統中，發揮止痛、鎮靜，參與調控攝食、脂肪聚集及胰島素抵抗等作用；CB2受體在免疫組織中有豐富的表達，脾臟邊緣區、免疫細胞、扁桃體、胸腺等，起免疫調節及抗炎作用[15-17]。近年大麻素類藥物在臨床應用中出現了成癮、抑郁或焦慮等中樞神經系統不良反應，考慮與CB1受體有關，部分藥物已被叫停。因此，學者們開始更關注對CB2受體的研究。CB2受體在中樞神經系統主要表達在小膠質細胞[18-19]。本實驗發現LPS可引起小膠質細胞活化或損傷，分泌炎性因子NO及IL-6明顯增多；給予CB2受體激動劑HU308處理后，可以減輕小膠質細胞的損傷，NO及IL-6分泌也顯著減少，且有劑量依賴性；這一結果證明激動小膠質細胞CB2受體可以對其起保護作用，并且抑制炎癥反應，從而可能發揮神經保護作用。

綜上所述，激動大麻素CB2受體，可以對損傷的小膠質細胞起保護作用，抑制其過度活化及炎癥反應，從而達到神經保護作用。此研究可以為神經保護類藥物的研發提供新的思路和理論基礎。

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