Wip1在甲狀腺癌細胞中表達的臨床及生物學意義

張文軍 鄭立春 柴連海 張曉明 夏安慶 胡耀杰

Wip1在甲狀腺癌細胞中表達的臨床及生物學意義

張文軍①鄭立春①柴連海②張曉明①夏安慶③胡耀杰④

目的：探討野生型p53誘導的磷酸酶1（wild-type p53-induced phosphatase 1，Wip1）在甲狀腺癌中的表達意義及其導入靶向Wip1的siRNA對甲狀腺乳頭狀癌K1細胞的生物學影響。方法：采用免疫組織化學方法、逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測73例甲狀腺癌組織及距其癌組織邊緣5 cm以上的鏡下未見浸潤的正常組織中蛋白、mRNA的表達情況。通過脂質體介導將Wip1基因siRNA瞬時轉染甲狀腺乳頭狀癌K1細胞，采用RT-PCR及Western blot檢測轉染后K1細胞內Wip1基因的表達水平，MTT比色法及流式細胞術（FCM）觀察細胞增殖、凋亡、周期變化情況。結果：Wip1蛋白在甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織中的表達陽性率分別為80.8%、9.6%，較正常甲狀腺組織明顯升高（χ2=47.036，P＜0.05）。Wip1 mRNA在甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織中的表達相對量分別為0.665±0.046、0.225±0.039，較正常甲狀腺組織明顯升高（t=12.637，P＜0.05）。Wip1蛋白、mRNA表達與甲狀腺癌患者性別、年齡及腫瘤大小無關（P＞0.05），而與淋巴結轉移、腫瘤臨床分期及腫瘤分化有關（P＜0.05）。RT-PCR及Western blot證實，siRNA沉默的K1細胞中Wip1 mRNA、蛋白的表達水平較未轉染組明顯降低（t=17.039，t=14.637，P＜0.05）。MTT、細胞凋亡及周期結果表明，siRNA沉默的K1細胞其增殖能力明顯減弱、細胞凋亡明顯增加，G0+G1期細胞數比例升高，而G2+M期和S期細胞數比例降低（P＜0.05）。結論：甲狀腺癌組織中Wip1蛋白和mRNA的表達均升高，且與甲狀腺癌淋巴結轉移、腫瘤臨床分期以及腫瘤分化有關，Wip1參與甲狀腺癌細胞增殖、凋亡、周期這一生物學過程。

Wip1 甲狀腺腫瘤 逆轉錄聚合酶連反應 Western blot免疫組織化學法

甲狀腺癌是女性較常見的頭頸部惡性腫瘤之一，目前其主要治療手段為手術+131I+甲狀腺激素替代治療［1］，而生物學治療手段亟需提高。因此分析甲狀腺癌的生物學特性，探索治療的新途徑成為臨床關注的問題。近年研究發現野生型p53誘導的磷酸酶1（wild-type p53-induced phosphatase 1，Wip1）基因在某些腫瘤中表現的生物學和遺傳學特征具有腫瘤原癌基因的特性，由此推測Wip1在甲狀腺癌形成和發展中的作用具有重要意義［2］。本研究采用免疫組織化學方法和逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chine reaction，RT-PCR）研究Wip1在甲狀腺癌中的表達情況，并通過改變Wip1表達含量的方法分析其對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響，以期為今后的臨床治療找到新的基因靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 前瞻性分析2008年5月至2012年12月期間唐山市工人醫院手術切除的73例新鮮甲狀腺癌標本（所有入組病例均取得受試者知情同意書，并通過相關倫理委員會批準），分別于腫瘤組織及距腫瘤邊緣5 cm以上（鏡下未見癌）的正常甲狀腺組織處取材。男性18例，女性55例；年齡29～74歲，中位年齡38歲。其中年齡≤40歲54例，＞40歲19例；腫瘤直徑≤4 cm 27例，＞4 cm 46例；高中分化24例，中低分化49例；淋巴結轉移：N0 23例，N+50例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期51例。全組患者術前均未經放、化療，標本均為術后立即取材，于液氮中保存。

1.1.2 細胞株及試劑 甲狀腺乳頭狀癌K1細胞株購自歐洲細胞培養中心（CAMR，Salisbury，英國）。Wip1兔抗人單克隆抗體（美國Epitomics公司），GAPDH鼠抗人單克隆抗體免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司），RNATrizol提取試劑盒（中國索萊寶公司），Super ScriptⅡ逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司），PCR擴增試劑盒（加拿大Fermentas公司）。

Lipofectimane 2000脂質體轉染試劑盒（美國Invitrogen公司），cDNA逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司），細胞周期試劑盒、FITC-Annexin V凋亡試劑盒（中國BestBio公司）。

1.2 方法

1.2.1 Wip1 siRNA與細胞培養 根據NCBI數據庫中Wip1基因序列和siRNA設計原則，由廣州市銳博生物科技公司設計合成Wip1特異性siRNA鏈，序列為：正義鏈：5'-CCAAUGAAGAUGAGUUAUAd TdT-3'；反義鏈：3'-dTdTGGUUACUUCUACUCAAUA U-5'。靶序列為CCAATGAAGATGAGTTATA，另外設計并合成與siRNA-Wip1基因組序列無同源性的陰性對照組siRNA-control，體外合成正義鏈和反義鏈RNA，并退火形成雙鏈RNA。K1細胞培養基：DMEM∶Ham's F12∶MCDB105（2∶1∶1）+10%胎牛血清，置37℃、5%CO2及95%空氣飽和濕度的恒溫培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染 轉染前24 h分別取對數生長期K1細胞以5×104個/孔接種于6孔板，細胞融合度達30%～50%時將siRNA與Lipofectimane 2000脂質體的混合物按濃度100 nmol/L轉染，并加入無血清Opti-MEM培養基培養，脂質體組按每孔僅加入含5 μL脂質體的Opti-MEM培養基，6 h后棄去培養基，加入含10%FBS的低糖DMEM培養基繼續培養，48 h后，行RT-PCR及Western blot檢測干擾效率。

1.2.3 免疫組織化學 將4 μm石蠟切片脫蠟至脫水，3%過氧化氫10 min阻斷內源性過氧化物酶，胰酶修復20 min，10%山羊血清室溫封閉20 min，滴加Wip1抗體（1∶100），濕盒中4℃冰箱過夜，滴加二抗及三抗，室溫濕盒內孵育各20 min，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水，封片。細胞計數在顯微鏡（×200）下，每張切片上隨機選擇5個視野，每個標本計數3張切片。Wip1表達以細胞陽性百分率及細胞染色強度得分之和進行判定。細胞陽性百分率分為4個等級：≤5%計0分，5%～25%計1分，25%～50%計2分，＞50%計3分；細胞染色強度分數標準：無染色記0分，弱染色（淺黃色）計1分，中等染色（黃褐色）計2分，強染色（棕黃色）計3分。兩項標準相加：0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.2.4 RT-PCR 總RNA提取：按Trizol試劑說明書要求，提取總RNA。逆轉錄：取2 μg總RNA，按SuperscriptⅡ逆轉錄試劑盒說明書要求操作合成cDNA，20 μL反應體系；反應條件為：變性65℃5 min，逆轉錄50℃50 min。PCR擴增Wip1基因上游引物為5'-GTTCGTAGCAATGCCTTCTCA-3'，下游引物為5'-CACTTTCTTGGGCTTTCATTTG-3'；GAPDH為內參照，上游引物為5'-CCGACCTGCCCTACGACTA-3'，下游引物為5'-CTGGGCTGTAACATCTCCCTT-3'。PCR反應體系50 μL包括：5 μL 10×PCR buffer，1 μL 10 mmoL dNTP，0.5 μL TaqDNA聚合酶，上下游引物各2 μL，1 μL模板cDNA，加ddH2O補足至50 μL。反應條件為：預變性95℃10 min，變性95℃30 s，退火56℃30 s，延伸72℃45 s，40個循環，置于4℃保存。PCR產物的檢測及半定量：產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果經凝膠成像系統結合Multi Gauge V3.1進行光密度分析。

1.2.5 Western blot 提取腫瘤組織和細胞總蛋白。4℃，12 000 r/min離心20 min，取上清，-20℃備用。BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，按每孔上樣量50 μg進行SDS-PAGE電泳，穩壓冰浴電轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育4℃過夜（Wip1 1∶500，GAPHD 1∶500），兔抗人紅外熒光標記二抗（1∶20 000），Odyssey雙色紅外熒光掃描系統進行檢測，計算蛋白相對值=蛋白A值/GAPDH A值。

1.2.6 MTT比色法 取處于對數生長期K1細胞，按5 000個/孔細胞，每孔體積200 μL接種于96孔培養板內。分別培養24、48、72、96 h后終止培養。終止培養前4 h，加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，除去每孔中培養基，加入DMSO 200 μL/孔，振蕩至結晶溶解。全自動酶標儀檢測各孔吸光度D值，檢測波長490 nm，參考波長620 nm。

1.2.7 細胞凋亡及細胞周期 取處于對數生長期K1細胞及轉染Wip1 siRNA后K1細胞。細胞凋亡：消化、收集細胞，用4℃預冷的PBS洗細胞2次，以1 mL結合緩沖液重新懸浮細胞，使其濃度為1×106，將100 μL的細胞懸液加入5 mL流式管中，每管加入5 μL Annexin V-FITC和10～120 μg/mL的碘化丙啶，避光均勻15 min，采用流式細胞儀上機檢測。細胞周期：消化、收集細胞，70%預冷的乙醇固定細胞，過夜后離心收集細胞，并以1 mL的PBS洗滌細胞，加入100 μg/mL RNase A 37℃孵育30 min，加入500 μL碘化丙啶染色液4℃避光孵育30 min，計數3×104個細胞，按標準程序流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 免疫組織化學及RT-PCR

正常甲狀腺濾泡上皮細胞中，Wip1免疫組織化學染色陰性或微弱（圖1A），甲狀腺癌組織Wip1陽性表達主要位于細胞核或細胞質（圖1B）。甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織其陽性表達率分別為80.8%（59/73）及9.6%（7/73），兩組間比較差異有統計學意義（χ2=47.036，P＜0.05，表1）。Wip1 mRNA在甲狀腺癌組織的表達量為0.665±0.046，高于正常甲狀腺組織（0.225±0.039），兩組間比較差異有統計學意義（t= 12.637，P＜0.05，圖2）。臨床因素分析表明，Wip1蛋白、mRNA表達與甲狀腺癌患者性別、年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05，表2）；有無淋巴結轉移、腫瘤臨床分期以及腫瘤分化中的表達差異有統計學意義（P＜0.05，表2）。

2.2 Wip1 siRNA轉染后鑒定

轉染48 h后觀察Wip1 siRNA的轉染效率在80%以上。RT-PCR結果表明，siRNA沉默的K1細胞中Wip1 mRNA表達的相對含量為0.313±0.023，而空白轉染組K1細胞Wip1 mRNA的相對含量為0.725± 0.035，兩組間比較差異有統計學意義（t=17.039，P＜0.05，圖3A）。Western blot結果表明，siRNA沉默的K1細胞中Wip1蛋白表達的相對含量為（0.376± 0.035），而空白轉染組K1細胞Wip1蛋白的相對含量為0.838±0.042，兩組間比較差異有統計學意義（t=14.637，P＜0.05，圖3B）。

2.3 細胞增殖、細胞凋亡及細胞周期

MTT檢測結果表明，轉染Wip1 siRNA 48 h后，與空白轉染組K1細胞的細胞存活率相比，轉染Wip1 siRNA K1細胞的存活率下調，兩組間比較差異有統計學意義（t=10.014，P＜0.05，圖4）。細胞凋亡結果表明，轉染Wip1 siRNA 48 h后，與空白轉染組K1細胞的早期細胞凋亡比率（2.2±0.3）%相比，轉染Wip1 siRNA K1細胞早期凋亡比率上調［（9.6±0.7）%］，兩組間比較差異有統計學意義（t=16.830，P＜0.05，圖5）。細胞周期結果表明，轉染Wip1 siRNA 48 h后，空白轉染組K1細胞的G0+G1期細胞數比例為（45.8± 2.5）%，G2+M期為（28.5±1.6）%，S期為（26.5± 1.3）%；而轉染Wip1 siRNA K1細胞的G0+G1期細胞數比例為（64.6±3.2）%，G2+M期（17.0±1.1）%，S期為（18.1±0.5）%，兩組間相比，差異有統計學意義（t= 7.972、3.079、10.446，P＜0.05）。

圖1 免疫組織化學方法檢測Wip1蛋白在甲狀腺癌組織及正常組織中的表達（SP×200）Figure 1 Protein expression of Wip1 in thyroid carcinoma and normal tissue was detected by immunohistochemistry（SP×200）

表1 Wip1蛋白在甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織中的表達Table 1 Expressions of Wip1 in thyroid carcinoma tissue and normal tissue

圖2 RT-PCR方法檢測Wip1 mRNA在甲狀腺癌組織及正常組織中的表達Figure 2 mRNA expression of Wip1 in thyroid carcinoma and normal tissue detected by RT-PCR method

表2 Wip1蛋白表達與甲狀腺癌臨床特征間的關系Table 2 Relation between Wip1 expression and clinical characteristics in thyroid carcinoma

圖3 RT-PCR、Western blot鑒定Wip1 mRNA及蛋白的表達Figure 3 Expression and identification of the Wip1 gene by siRNA-targeting Wip1

圖4 MTT法檢測Wip1 siRNA對K1細胞增殖的影響Figure 4 Effect of Wip1 siRNA on cell proliferation

圖5 流式細胞術檢測Wip1 siRNA對K1細胞凋亡的影響Figure 5 Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry using Annexin V-FITC/PI staining

3 討論

Wip1是一種具有絲/蘇氨酸酶活性的蛋白磷酸酶，位于人染色體17q22/q24區域，人Wip1蛋白分子量約61 kD，由605個氨基酸組成。近年來，研究相繼發現Wip1在乳腺癌［3］、神經母細胞瘤［4］、髓母細胞瘤［5］等腫瘤中高表達，并能通過p38MAPK/p53信號通路對p53起負反饋調控，導致p53表達下降及誘導p53突變，與患者預后密切相關［6］。

本研究首次用免疫組織化學法和RT-PCR技術對甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織進行定位及定量檢測，結果顯示Wip1蛋白、mRNA在甲狀腺癌組織中的表達水平均顯著高于正常甲狀腺組織，取得了一致結果，提示與Wip1在多形性膠質母細胞瘤［7］、室管膜瘤［8］、甲狀腺癌乳頭狀癌［9］、結直腸癌［2］等組織中的表達水平明顯高于其正常組織的結果一致。本組結果的單因素分析也顯示，Wip1蛋白、mRNA的表達水平與癌組織有無淋巴結轉移，臨床分期及腫瘤分化有關，但與甲狀腺癌患者性別、年齡、腫瘤大小無關。有研究［9］結果提示Wip1蛋白表達水平與甲狀腺癌乳頭狀癌患者的年齡、性別、腫瘤大小無關。DNA損傷時，共濟失調-毛細血管擴張突變基因（ataxia-telangiectasia-mutated，ATM）使Chk2磷酸化，阻止腫瘤的發生。而Wip1與Chk2結合使其去磷酸化失活，導致腫瘤的發生。體內、外實驗證實Wip1也可以抑制Chk1去磷酸化失活導致腫瘤的發生［10］。進一步研究證實Wip1高表達打破了以p38 MAPK-p53-Wip1途徑維持的內環境穩態，通過p38 MAPK蛋白去磷酸化作用導致下游Wnt-p53蛋白失活，以及降低p16蛋白水平促進人乳腺細胞的惡性發生［9］。本研究進一步體外實驗首次發現：siRNA沉默的甲狀腺癌K1細胞其增殖能力明顯減弱、細胞凋亡明顯升高，G0+G1期細胞數比例增加，而G2+M期和S期減少。有研究通過siRNA技術沉默膠母細胞瘤細胞株U251中高表達Wip1達到抑制腫瘤細胞增殖的目的［11］。有研究發現，通過RNAi技術沉默髓母細胞瘤D283細胞高表達的Wip1，使P53表達增高，能夠誘導腫瘤細胞凋亡增加［8］。另有研究發現，通過脂質體介導將Wip1 siRNA瞬時轉染肺腺癌A549細胞，其G1期細胞比例增加，S期細胞比例降低［12］，并分析這可能與Wip1在NF-κB、Notch、Wnt的信號通路中發揮廣泛作用有關，這些通路在細胞增殖、細胞凋亡、周期轉換、血管生成以及上皮細胞間質化中起了重要的作用［13-15］。

綜上所述，本研究結果提示，甲狀腺癌組織中Wip1蛋白和mRNA的表達均升高，且與甲狀腺癌淋巴結轉移以及腫瘤臨床分期有關。Wip1參與甲狀腺癌細胞增殖、凋亡、周期這一生物學過程。

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（2014-03-05收稿）

（2014-04-21修回）

（本文編輯：邢穎）

Expression and clinical significance of Wip1 in thyroid carcinoma and biological effect of siRNAtargeting Wip1 on its cell line

Wenjun ZHANG1,Lichun ZHENG1,Xiaoming ZHANG1,Anqing XIA2,Yaojie HU3,Lianhai CHAI4

Wenjun ZHANG;E-mail:wenjun_zhang2014@163.com
1Department of Nuclear Medicine,2Pathology Division,3Department of Head and Ncek Surgery,4Experimental Center,Tangshan Worker's Hospital,Tangshan 063000,China.

Objective:To investigate the expression and clinical significance of wild-type p53-induced phosphatase 1(Wip1)in thyroid carcinoma and biological effect of siRNA-targeting Wip1 on the thyroid carcinoma cell line.Methods:Immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)were performed to detect the expression of Wip1 in 73 specimens of thyroid carcinoma tissues and normal thyroid tissues(5 cm away from the margin of thyroid carcinoma),respectively.Wip1 siRNA was transiently transfected into the papillary thyroid carcinoma cell by using a liposome-mediated method and then detected by RT-PCR and Western blot.Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay and flow cytometry(FCM)were also conducted to observe cell proliferation, cell apoptosis,and cell cycle.Results:The positive rates of Wip1 protein were 80.8%in thyroid carcinoma tissues and 9.6%in the normal tissues(χ2=47.036,P＜0.05).The relative mRNA contents of Wip1 were 0.665±0.046 and 0.225±0.039 in carcinoma and normal tissues,respectively;these results significantly differed between the two types(t=12.637,P＜0.05).Significant correlation was not observed between Wip1 expression and other factors,such as patient's gender,age,and tumor size(P＞0.05).However,significant correlations among Wip1 expression,lymph node metastasis,clinical stages and tumor differentiation(P＜0.05)were observed.RT-PCR and Western blot results showed that K1 cell-transfected Wip1 siRNA exhibited a relatively lower expression than normal cells(t=17.039,t= 14.637,P＜0.05).MTT assay results showed that the K1 cells transfected with Wip1 siRNA showed a lower survival fraction,higher cell apoptosis,higher percentage of G0/G1phases,and lower cell concentration in G2/M and S phases(P＜0.05).Conclusion:Wip1 protein and mRNA were increased in thyroid carcinoma and are correlated with lymph node metastasis,clinical stages and tumor differentiation.Wip1 may be involved in proliferation,apoptosis,and cycle of thyroid cancer cells.

Wip1,thyroid carcinoma,RT-PCR,Western blot,immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.20140291

①唐山市工人醫院同位素科（河北省唐山市063000）；②實驗中心；③病理科；④頭頸外科

張文軍 wenjun_zhang2014@163.com

張文軍 專業方向為甲狀腺癌同位素治療。

E-mail：wenjun_zhang2014@163.com