LTF基因在胃癌細胞株BGC823中的表達及其與啟動子甲基化的相關性

諸葛小菊，陳仁聘，黃燮林，陳超，盧的一，黃智銘，吳金明，吳建勝

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 消化內科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學 仁濟學院，浙江溫州 325035）

胃癌的發病率高居惡性腫瘤的前4位，其發病過程受到多基因、多因素的影響[1]。越來越多的證據表明抑癌基因的失活在腫瘤發生發展中起重要作用。在胃癌癌變早期，抑癌基因的表觀遺傳學改變占有重要的地位，尤其是抑癌基因啟動子的異常甲基化[2]。

Lactotransferrin（LTF）基因位于人類染色體3p21.3區域，其在鼻咽癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤及相應的腫瘤細胞株呈現表達降低或缺失的狀態，有研究[3-6]顯示這與該基因啟動子區域的異常甲基化高度相關。5-Aza-2’-deoxycytidine（5-aza-CdR）能結合DNA甲基轉移酶I并使其失活，逆轉抑癌基因的高甲基化狀態，重新激活基因表達。而目前對于LTF基因在胃癌內的研究尚少，因此本研究選擇胃癌細胞株BGC823，觀察LTF基因的表達和其啟動子甲基化狀態，旨在研究胃癌細胞株內LTF基因表達水平和啟動子異常甲基化的相關性，為胃癌臨床診斷治療提供一個新的可能靶點。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細胞株BGC823購于中國上海科學院細胞庫；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；PRMI-1640、PBS、青/鏈霉素100 U/mL購于Gibco公司；5-aza-CdR（Sigma公司），用培養基充分溶解配成適量濃度的母液，分裝后存于-80 ℃備用；TRIzol購于Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、real-time PCR試劑盒（SYBR?Green Re altime PCR Master Mix）購于日本TOYOBO公司；亞硫酸氫鈉修飾試劑盒購于美國ZYMO公司；Ex Taq HS DNA聚合酶、pMD 19-T Vector購于日本TaKaRa公司；抗體anti-Lactoferrin購于美國Abcam公司（77 kDa，1:1 000#ab10110；Abcam，Cambridge，UK）；β-actin antibody購于中國碧云天（42 kDa，1:1 000，Beyotime，中國上海）。熒光定量PCR儀為BIO-RAD（型號CFX96）。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養和5-aza-CdR藥物處理：BGC82 3細胞用含10%胎牛血清的PRMI-1640培養液放置在37 ℃，5% C02的細胞培養箱內培養。以1×105均勻鋪入六孔板內，生長過夜。饑餓處理16 h，然后給予0 μmol/L（對照組）、2 μmol/L、10 μmol/L的5-aza-CdR藥物處理，24 h換液一次，培養5 d后處理細胞。

1.2.2 real-time PCR檢測藥物干預前后LTF基因mRNA表達：取對照組和藥物處理組的回收細胞，用TRIzol提取細胞總RNA。約取1 μg總RNA根據反轉錄試劑盒說明書反應得到20 μL體系的cDNA。以得到cDNA為模板，進行real-time PCR反應。引物由上海生工公司設計并合成，用GAPDH作為內參，引物序列分別為上游5’-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3’，下游5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3’，擴增產物長度113 bp。LTF引物序列分別為：上游5’-TACAAATC CCAACAAAGCAGTG-3’，下游5’-CTTCCACAGGTCTATCC ACACA-3’，產物大小約58 bp。20 μL PCR體系包括：Realtime PCR Master Mix 10 μL，Plus solution 2 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）1.2 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1.2 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 3.6 μL。反應條件是95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s、62 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s進行40個循環。擴增結束進行熔解曲線分析來辨別是否有非特異性擴增。實驗重復3次。數據 用2-ΔΔCt法分析。

1.2.3 Western blot法檢測藥物干預前后LTF基因蛋白表達：回收對照組和藥物處理組細胞，加入適量的蛋白抽提cell lysis buffer（每孔50μg）裂解細胞，然后用BCA法測定蛋白質的濃度。用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，將蛋白用半干式電轉移法轉至硝酸纖維膜上，用5%脫脂牛奶TBST封閉硝酸纖維膜，室溫下搖2 h。與一抗anti-Lactoferrin（77 kDa）結合（以TBS稀釋，濃度依抗體而定），4 ℃搖過夜，TBST洗4次，每次5 min，用β-actin antibody（42 kDa）作為內參。加入二抗（以TBS稀釋，濃度依抗體而定），室溫搖1 h，TBST洗4次，每次5 min。用ECL試劑盒進行化學發光檢測。X線片壓片、顯影、定影。

1.2.4 亞硫酸氫鹽修飾DNA和BSP反應：取對照組和藥物處理組的回收細胞，按DNA提取試劑盒提取胃癌細胞株的基因組DNA。然后按甲基化修飾試劑盒進行亞硫酸氫鈉修飾，使未甲基化的胞嘧啶（C）轉化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不變。以修飾后基因組DNA為模板，用Ex Taq HS DNA聚合酶進行LTF基因啟動子擴增。LTF特異性引物參考文獻[5]，分別是上游5’-TTGAGATTAGAGTTGGGATAGGG-3’，下游5’-CCCCCAAACACCTACACTCA-3’，產物長度為397 bp。其反應體系為50 μL，包括：TaKaRa Taq HS 0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1μL，模板DNA 1 μL（≤50 ng），ddH2O 37.75 μL。反應條件為95 ℃變性15 min，94 ℃ 30 s、56℃ 30 s、72 ℃ 30 s進行35次循環，然后72 ℃延伸7 min。將獲得的PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統記錄數據。

1.2.5 挑選陽性克隆和測序：于紫外燈下切取含目的DNA的條帶，按DNA凝膠回收試劑盒說明書對PCR產物進行回收純化。取回收純 化的DNA 4.5 μL，與pMD 19-T Vector 0.5 μL、solution I 5 μL配成10 μL體系，輕輕混勻后16 ℃連T載體12 h。取2.5 μL連接產物與25 μL的大腸桿菌感受態冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，冰上放置3 min，加入不含氨芐青霉素的LB培養基600 μL，37 ℃，250 r/min振搖45 min，離心將菌液濃縮為15 μL，并涂于氨芐（100 μg/mL）抗性的LB平板上，先正面向上放置平板1 h風干，翻轉倒置平板37 ℃培養過夜，12～16 h后即可長出菌落。隨機挑選15個單克隆菌落，放在500 μL LB液體培養基（含有氨芐青霉素100 μg/mL），搖渾濁菌液。用普通PCR鑒定陽性重組子，取1 μL搖渾的菌液做PCR模板，2×Taq酶Mix 5 μL，上下游通用引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL構成10 μL PCR體系進行擴增反應。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果。最后送檢10個克隆于上海生工公司測序。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS13.0統計軟件。real-time PCR結果和總體甲基化率組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。CpG位點甲基化率比較用行×列表卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌細胞株BGC823 LTF基因的mRNA 表達 不同濃度5-aza-CdR處理胃癌細胞株BGC823后，藥物處理的兩組其mRNA表達較對照組明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05），但藥物處理組間差異無統計學意義（P＞0.05）。結果如圖1A所示。我們用Western blot方法檢測藥物干預前后LTF基因蛋白表達，結果如圖2所示，對照組LTF表達低，兩個不同濃度的藥物組較對照組表達明顯增加。

圖2 5-aza-CdR藥物處理前后LTF的蛋白表達

2.2 胃癌細胞株BGC823藥物處理前后LTF基因甲基化情況 BSP結果電泳圖如圖3所示，目的條帶397 bp清晰。LTF基因連接T載體后挑選陽性克隆電泳結果如圖4所示，表明所選陽性單克隆概率高，達83.3%（5/6）。

圖3 LTF基因的BSP法電泳圖結果

圖4 LTF甲基化后目的DNA連T載體挑選陽性克隆電泳圖

BGC823被不同濃度5-aza-CdR處理后LTF其總體甲基化率統計見圖1B，其中對照組表明胃癌 細胞株BGC823明顯高甲基化，而藥物處理后的兩組啟動子甲基化情況被逆轉，且兩個藥物處理組和對照組比差異有統計學意義（甲基化率對照組為53.6%，藥物濃度2μmol/L組為27.9%，濃度10μmol/L組為35.0%）（P＜0.05），但藥物處理組間差異無統計學意義（P＞0.05）。LTF基因啟動子區14個CpG位點甲基化情況如圖5顯示，其中3、4、5、8、10、11、12、13、14號CpG位點甲基化程度超過50%，呈高甲基化狀態。而用5-aza-CdR處理后，與對照組相比，14號位點甲基化情況幾乎沒有變化，3、8這兩個CpG位點甲基化率較對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

胃癌的發生機制是涉及多因素多步驟的一個過程，主要包括遺傳性因素和表觀遺傳學因素改變的堆積，而后者主要包括啟動子區甲基化、雜合性丟失、組蛋白修飾三方面。越來越多的研究表明DNA啟動子區甲基化在腫瘤的發生發展過程中占有重要的地位。Lund等[7]認為DNA甲基化在某種時候甚至超越基因缺失和基因突變，是抑癌基因失活的唯一機制。DNA甲基化是一可逆過程，5-aza-CdR作為一種甲基化轉移酶，可以成功逆轉DNA的甲基化程度，使得原先因甲基化而失活的基因能夠重新表達或表達增強，恢復正常的細胞調控功能。這提示去甲基化劑治療能夠逆轉基因的甲基化狀態，具有一定的應用前景。

圖5 5-aza-CdR藥物處理前后LTF基因啟動子區14個CpG位點甲基化情況

研究發現人體染色體3p21.3區域存在一群高密度分布的腫瘤抑制基因簇（TSGs），該區域的抑癌基因在肺癌、乳腺癌、腎癌和其他腫瘤中常常表達缺失[8]。LTF基因，亦是其中重要一員，編碼乳鐵蛋白（lactoferrin，LF），其主要存在于哺乳動物的乳液、唾液、淚液、精液等外分泌物中，能參與體內鐵代謝、抗菌、細胞生長和分化、免疫調節和抗炎癥反應、抗氧化反應等多種生物學效應[9-10]。近來研究發現，LF在抑制腫瘤生長、轉移，促進腫瘤細胞凋亡方面也有重要作用[11]。

Iijima等[5]報道LTF基因在59%（16/27）小細胞肺癌細胞株，77%（33/43）非小細胞肺癌細胞株，54%（7/33）原發性非小細胞肺癌內表達缺失，且與DNA甲基化高度相關。研究[6]發現LTF基因mRNA在74%前列腺癌患者中呈低表達，而且LTF相對高表達的前列腺癌患者有更好的預后，這反映LTF在前列腺癌患者中有保護性的功能。DNA去甲基化劑地西他濱（decitabine）能使LTF基因在前列腺癌細胞株LAPC4中被強激活表達。LTF基因在多種腫瘤內表現為一種有潛力的抑癌基因，其失活機制和DNA啟動子區高度甲基化相關。本研究觀察藥物處理組和對照組發現，隨著藥物處理組DNA甲基化率的下降，其LTF mRNA表達增加，這說明LTF基因在胃癌里的表達是可以被逆轉的，而且其機制和DNA甲基化高度相關。但是兩個藥物處理組間的甲基化率和mRNA表達差異無統計學意義，這可能和5-aza-CdR對BGC823的去甲基化作用達到平臺期相關。重亞硫酸鹽修飾DNA測序法，是公認的DNA甲基化分析的金標準。本研究用該方法檢測發現，低分化型胃癌細胞株BGC823啟動子區甲基化程度高達53.6%，該段DNA啟動子區含有14個CpG島，CpG島是一段長約1 kb的富含飾CpG和GpC序列的DNA結構。進一步分析發現3、4、5、8、10、11、12、13、14號CpG位點甲基化程度超過50%，呈高甲基化狀態，而用5-aza-CdR處理后，14號位點甲基化率幾乎沒有變化，而3、8這兩個CpG位點甲基化率較對照組下降，差異有統計學意義（P＜0.05），猜測這兩個位點和LTF基因在胃癌中的表達缺失及逆轉其表達可能相關。

大量研究證明LF在體內外實驗中有抗腫瘤作用[12-14]，但是其機制目前并不明確。LF能以影響細胞周期的正常運轉來抑制腫瘤細胞的增殖，Zhang等[4]用LTF轉染鼻咽癌細胞株后，發現，細胞停滯在G1期，而S期、G2-M期細胞減少。有研究[15]認為LF能以調節細胞周期相關蛋白和抑癌基因（p53和Rb）的表達來影響細胞周期的整個進程。但是亦有報道持不同意見，認為LF補給治療能調節MAPK（mitogenactivated protein kinase）通路卻不會影響p53的表達[14]。體外實驗證明注射LF能抑制小鼠體內移植實體瘤的大小，Fujita等[16]發現LF在小鼠結腸癌發展過程中，激活Fas信號通路導致結腸癌細胞的凋亡。當然，對于LTF基因在胃癌內的抑癌機制是否涉及以上幾種，需更多的實驗研究。

DNA甲基化作為表觀遺傳學重要機制之一，其本身優勢在于不涉及基因序列的改變就可以調控基因的表達，并且能夠被甲基化轉移酶抑制劑逆轉。5-aza-CdR，作為一種甲基化轉移酶，已成功應用于白血病的臨床治療[17]，這對抑癌基因甲基化異常相關的腫瘤來說是個成功的例子。針對LTF基因在胃癌內表達和基因甲基化機制的關聯，提示我們未來可能通過甲基化轉移酶抑制劑來進行腫瘤的預防和早期治療，當然這還需要進一步的實驗及臨床研究。

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