莪術醇軟膏對糖尿病潰瘍創面愈合的作用

周潔，朱雁林，董建勇，傅紅興，裘關關，方亮蓮，林濰濰

（溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

糖尿病潰瘍是常見的糖尿病慢性并發癥之一，糖尿病患者中，潰瘍的發病率約占4%～10%，是導致糖尿病患者致殘和早亡的主要原因[1]，也是醫療費增加的主要因素[2-3]，患者皮膚損傷后創面愈合延遲或不愈合成為臨床亟待解決的難點和熱點[4]。研究表明，活血化瘀藥在調節血管內皮細胞的內環境及其分泌功能，逆轉內皮功能方面已取得較大進展[5]。

溫莪術是臨床上較為常用的活血化瘀藥物，從其藥用部位莪術油中提取的成分莪術醇具有抗腫瘤、抗炎、抗纖維化、抗氧化、促進血管生成及低細胞毒性特點[6-9]。本研究通過使用自制的莪術醇軟膏，比較糖尿病大鼠與正常大鼠皮膚潰瘍愈合情況及皮膚中膠原含量、內皮細胞黏附分子（CD31）及轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達差異，探討其在糖尿病潰瘍創面修復中的作用，為將來該莪術醇軟膏的臨床應用提供實驗參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SD雄性大鼠48只，體質量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供，飼養于溫州醫科大學實驗動物中心，單籠飼養，恒溫18～22℃，恒濕，自由飲水、攝食。本實驗征得溫州醫科大學動物倫理委員會同意。

1.1.2 試劑和儀器：莪術醇由本實驗室從莪術油中分離得到，經氣相色譜鑒定純度為99.3%；鏈脲佐菌素（Steptozocin，STZ）（美國Sigma公司）；羅氏血糖儀（德國羅氏公司）；電子分析天平（AL-104，瑞士Mettler Toledo公司）；HE染色試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；Masson三色染色試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；兔抗鼠CD31多克隆抗體（克隆號：M-20，稀釋倍數：1:50，Santa Cruz公司，德國）；兔抗鼠TGF-β1一抗（美國Santa Cruz公司）；RM 2135超薄切片機（德國萊卡leica公司）；EC 350-1石蠟包埋機（德國萊卡leica公司）；光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 軟膏的制備：將白凡士林、羊毛脂、液體石蠟按照10:1:1的配比加熱充分攪拌混合均勻，配成空白軟膏劑基質，再稱取莪術醇混懸在少量超純水中后加入軟膏基質中充分攪拌，分別制成5%和10%的含藥軟膏[10-12]。

1.2.2 糖尿病潰瘍造模：SD大鼠于實驗前適應性喂養1周，隨機抽取12只SD大鼠作為正常組，其余36只作為糖尿病造模組，過夜禁食13 h后，腹腔注射STZ（55 mg/kg），用pH 4.2的0.1 mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液配成10 mg/mL溶液，1周后尾靜脈采血測血糖，當血糖值≥16.7 mmol/L且伴隨出現“三多一少”癥狀者即為糖尿病造模成功[13]，再經過1周觀測大鼠飲水飲食狀況并記錄血糖值后進行糖尿病潰瘍模型制作。

潰瘍制作方法[14]：10%水合氯醛0.3 mL/kg將大鼠麻醉，剔除背部毛發，再用脫毛膏去除殘余毛發，用75%乙醇消毒背部皮膚，用外科手術剪剪去背部脊柱兩側對稱部位直徑1.8 cm的圓形全層缺失皮膚創面，深至筋膜，止血后以無菌紗布包扎備用。1.2.3 動物分組及給藥：將造模成功的36只大鼠隨機分成3組：空白基質組、5%莪術醇軟膏組、10%莪術醇軟膏組。單籠喂養每天固定時間給藥1次，給藥前用0.9%氯化鈉溶液清洗創面，莪術醇軟膏給藥以覆蓋創面為宜。

1.2.4 皮膚愈合指標的測定：給藥后每天觀察創傷表面及其周圍的炎癥反應、創傷的愈合情況，于創面給藥治療后第3、第7、第14和第21天分別對大鼠進行潰瘍創面拍照，用Image-Pro Plus 5.0軟件測定潰瘍創面面積，潰瘍愈合率計算公式：

創面愈合率=（原始創面面積-未愈合創面面積）/原始創面面積×100%

1.2.5 皮膚標本采集：于給藥后第3、第7、第14和第21天分別取創面標本，每個時間點每組處死3只大鼠，取創面組織標本，固定在4%多聚甲醛中，留作病理學觀察及免疫組織化學指標檢測。

1.2.6 大鼠皮膚潰瘍面HE及Masson染色：取4%多聚甲醛里固定24 h后的標本，將其放入不同濃度乙醇水溶液中進行脫水，二甲苯透明后常規石蠟包埋縱向連續切片（5μm），行HE及Masson染色，顯微鏡下檢查創面組織的病理形態，肉芽組織增生情況及上皮組織的形成。

1.2.7 免疫組織化學：用CD31及TGF-β1免疫組織化學法分別探查創面組織的血管化和細胞增殖陽性表達率。取石蠟包埋標本，進行超薄切片（5μm），用1:5多聚賴氨酸處理過的載玻片進行撈片，撈片后于烘箱烘片4 h，再經脫蠟至水、抗原修復和封閉后，切片上分別滴加一抗，37 ℃孵育1 h，隨后二抗孵育，最后用DAB顯色、蘇木素輕度復染、脫水、透明和封片。

判斷標準：顯微鏡下觀察到胞質或胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，無棕黃色顆粒者為陰性結果。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS 19.0統計軟件。實驗數據以±s表示，所有數據均進行正態性檢驗及方差齊性檢驗。多組樣本均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模后血糖及體質量變化 經STZ造模后，兩組大鼠不同時期血糖和體質量的變化情況見表1-2。糖尿病造模組大鼠血糖明顯高于正常組，體質量較正常組增長緩慢，造模較為成功。

表1 兩組注射STZ后血糖濃度比較（±s，mmol/L）

與正常組比：aP＜0.05

組別 n 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天糖尿病造模組 3 6 2 0.8 2±2.0 5 a 2 1.8 0±1.8 4 a 2 2.5 9±2.2 8 a 2 2.4 7±2.2 4 a正常組 1 2 6.3 2±1.0 8 6.7 5±1.0 6 6.3 9±1.0 2 6.3 1±0.5 3

2.2 創面愈合情況及愈合率比較 在第3、第7、第14和第21天莪術醇軟膏促進創面愈合明顯快于空白基質組（見圖1）。5%與10%兩種不同濃度的莪術醇軟膏相比較，隨著肉芽組織的大量形成和逐漸成熟，傷口逐漸縮小并逐漸愈合，且10%莪術醇軟膏組的愈合率高于5%莪術醇軟膏組，但兩者差異不明顯（P＞0.05），見表3。說明莪術醇軟膏刺激了上皮的再生化，促進了糖尿病潰瘍的創面愈合。

表2 兩組注射STZ后體質量變化比較（±s，g）

表2 兩組注射STZ后體質量變化比較（±s，g）

與正常組比：aP＜0.05

組別 n 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天糖尿病造模組 3 6 2 0 9.9±1 1.6 2 2 3.9±1 4.9 a 2 5 7.6±4 8.5 a 2 7 1.6±5 1.9 a正常組 1 2 2 0 3.8±7.3 2 5 5.8±1 5.2 3 4 8.3±2 8.4 3 8 3.5±3 9.2

表3 實驗性糖尿病潰瘍大鼠潰瘍愈合率（n=12，±s，%）

表3 實驗性糖尿病潰瘍大鼠潰瘍愈合率（n=12，±s，%）

與空白基質組比：aP＜0.05

組別 第3天 第7天 第14天 第21天空白基質組 10.1±7.3 40.8±12.5 80.4±7.5 90.5±2.7 5%莪術醇軟膏組 18.2±12.4a 61.7±5.2a 88.1±4.8a 95.6±1.5a 10%莪術醇軟膏組 18.1±11.2a 65.3±8.2a 90.4±8.9a 98.7±4.5a

圖1 各組創面愈合隨造模后時間的變化情況

2.3 病理組織學觀察

2.3.1 HE和Masson染色結果：創面組織的HE染色和Masson染色分別如圖2和圖3所示。

圖2 創傷后第3、第7、第14和第21天各組的HE染色比較（×200）

圖3 創傷后第3、第7、第14和第21天各組的Masson染色比較（×200）

5%莪術醇軟膏組：第3天時炎癥細胞出現浸潤；第7天時肉芽組織生成；第14天時上皮組織開始形成，炎癥細胞開始消退，成纖維細胞增加；第21天時創面基本上皮化，上皮層較空白基質組厚。隨劑量加倍，10%莪術醇軟膏組與5%莪術醇軟膏組相比，第14天肉芽組織開始填充且在第21天時肉芽組織更厚，膠原纖維染色呈束狀排列且更為緊密規整。空白基質組：第3天時可減少量炎癥細胞浸潤，膠原纖維排列疏松且不規則；第7天時可見炎癥細胞比第3天時多，炎癥細胞出現緩慢，且傷口有化膿現象；第14天時炎癥細胞聚集，膠原纖維和成纖維細胞形成少，創面上皮化較給藥組少。

2.3.2 CD31免疫組織化學：CD31的免疫組織化學將小血管的內皮細胞膜染成棕色（見圖4）。創面組織的CD31的免疫組織化學結果如圖4所示。在造模給藥后第7天和第14天空白對照組和給藥組CD31表達量均有不同程度的提高，且在給藥10%莪術醇組CD31的表達量較多。在造模后第21天時，3組的CD31表達量都有所降低（見表4）。

圖4 創傷后第3、第7、第14和第21天各組CD31表達的比較(×200)

表4 3組CD31陽性表達率比較（n=12，±s，%）

表4 3組CD31陽性表達率比較（n=12，±s，%）

與空白基質組比：aP＜0.05

組別 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天空白基質組 1 6.8 7±6.0 1 2 3.4 3±6.0 9 3 2.0 0±4.1 0 2 7.6 3±3.0 5 5%莪術醇軟膏組 2 3.8 8±3.1 2 4 5.6 7±2.3 2 a 5 0.3 2±2.8 4 a 4 3.8 6±2.0 8 a 1 0%莪術醇軟膏組 3 3.0 1±3.1 1 5 0.3 0±2.0 9 a 5 9.2 2±1.2 4 a 5 3.3 0±6.0 7 a

2.3.3 TGF-β1免疫組織化學：TGF-β1可以作用于成纖維細胞，產生細胞增生分化，合成膠原蛋白，調節創傷中各細胞間的相互作用。創面組織TGF-β1的免疫組織化學結果如圖5所示。在造模后第7天，5%和10%莪術醇軟膏組均有促進TGF-β1的表達，且給藥組的表達量均高于空白基質組。在給藥后第14天5%、10%莪術醇軟膏組TGF-β1表達量達到頂峰。第7天和第14天時10%莪術醇軟膏組的TGF-β1表達量高于5%莪術醇軟膏組，而在第21天時10%莪術醇軟膏組TGF-β1表達量較5%莪術醇軟膏組略有下降（見表5）。

圖5 創傷后第3、第7、第14和第21天后各組TGF-β1表達的比較（×200）

表5 3組TGF-β1陽性表達率比較（n=12，±s，%）

表5 3組TGF-β1陽性表達率比較（n=12，±s，%）

與空白基質組比：aP＜0.05

組別 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天空白基質組 2.3 3±0.5 8 4.3 3±1.5 3 5.6 7±0.5 8 5.3 3±0.2 3 5%莪術醇軟膏組 3.6 7±1.5 3 8.0 0±2.6 5 a 1 6.6 7±1.1 5 a 1 5.0 0±1.0 4 a 1 0%莪術醇軟膏組 3.2 5±0.9 6 1 1.3 3±1.5 3 a 1 9.5 0±3.1 1 a 1 3.0 0±1.8 3 a

3 討論

據世界衛生組織最新公布的數據顯示，我國已成為世界第一糖尿病大國，患病率為9.7%，已高于世界平均水平的6.4%[15]。作為糖尿病并發癥之一的糖尿病難愈合創面的修復不僅困擾著臨床醫生，也是醫學界面臨的重大難題[4]。其中皮膚組織中血管退化，創面中血管生成遲滯，可能是糖尿病創面難愈的重要原因[16]。利用血管活性藥物擴張血管，改善局部組織的微循環，增加氧供，在臨床上已有廣泛的應用[17]。臨床病理發現，從糖尿病足潰瘍中分離出的成纖維細胞其生理受損，分泌各類生長因子的功能降低，且增殖功能顯著降低[18]。因此刺激或修復創面成纖維細胞的增殖、遷移功能，進一步誘導膠原生成的治療也是促進糖尿病傷口愈合的研究方向。

傷口愈合是十分復雜的生物學過程，包括早期炎癥細胞聚集，多種細胞的增生，毛細血管的形成等。充分的血供為組織修復提供充分的營養物質，保證了組織再生所需，有利于各種修復細胞增殖和發揮其功能活性，也是促進創面愈合創面微循環改善的重要標志[19]。而成纖維細胞在組織創傷修復過程中起保護創面、填補傷口等作用，因此，大量的成纖維細胞增殖及充分的血液循環是傷口愈合的關鍵。CD31可以探查創面組織血管化程度，創面的微血管組織中血管內皮細胞迅速增殖，進而形成新生微小血管以滿足組織修復所需的營養與氧供，因此CD31陽性表達率是創面血管微循環改善的重要標志之一[20]。TGF-β1抗原表達多少與成纖維細胞增殖關系密切，是評價細胞增殖狀態較好的指標[21]。大量的成纖維細胞在創基內增殖、遷移、分化，分泌大量的膠原基質，轉化為肌成纖維細胞，充填組織缺損的同時與膠原基質協同作用收縮創面。

在本實驗中，第3天時創面處于炎癥水腫期，創面肉芽組織生長在起始階段，3組間創面愈合率、膠原著色差異不明顯，CD31和TGF-β1陽性表達率均不明顯，5%和10%莪術醇軟膏組與空白基質組相比差異不明顯；第7天時，從表觀上觀察3組創面面積都開始減小，傷口邊緣逐漸開始收縮，而5%和10%莪術醇軟膏組的潰瘍愈合率與空白基質組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）；第14天時，3組處于潰瘍修復過程中肉芽組織填充期間，傷口中心可見有新生上皮，可觀察到給藥組血管增生現象較第3天明顯增強，10%莪術醇軟膏組CD31和TGF-β1陽性表達率均高于5%莪術醇軟膏組。此外成纖維細胞大量增殖，并開始分泌大量的膠原纖維。第21天時，10%莪術醇軟膏組創面接近于愈合，膠原纖維粗大，大量細長梭狀的纖維細胞呈束狀排列，CD31的表達量高于5%莪術醇軟膏組，但是TGF-β1表達量低于5%莪術醇軟膏組，而空白基質組，纖維細胞少且排列不規則，有較多膠原纖維增生，但呈不規則分布，細胞間質疏松明顯。

本實驗通過觀測糖尿病大鼠皮膚的愈合率，HE與Masson染色，及傷口愈合密切相關的病理組織學指標CD31、TGF-β1的陽性表達，發現莪術醇軟膏促進糖尿病潰瘍創面愈合可能是通過促進成纖維細胞增殖，以及膠原的合成，與新生的毛細血管等共同形成肉芽組織，填補傷口組織缺損，從而促進表皮細胞的覆蓋，達到傷口愈合的目的。且隨給藥濃度的加大，10%莪術醇軟膏較5%莪術醇軟膏能更快促進創面愈合，并在病理切片HE染色及免疫組織化學染色的結果中其膠原合成、CD31的陽性表達、TGF-β1蛋白陽性表達上更優，與表觀愈合情況一致。當然，傷口愈合是一個極其復雜的過程，莪術醇軟膏是否通過其他途徑產生作用還有待于進一步研究。

[1]王軍, 楊瑞, 袁向科, 等. 金黃膏外敷治療糖尿病潰瘍的實驗研究[J]. 天津中醫藥, 2010, 27(4): 325-327.

[2]Harrington C, Zagari MJ, Corea J, et al. A cost analysis of diabetic lower-extremity ulcers[J]. Diabetes Care, 2000,23(9): 1333-1338.

[3]Gordois A, Scuffham P, Shearer A, et al. The health carecosts of diabetic peripheral neuropathy in the US[J]. Diabetes Care, 2003, 26(6): 1790-1795.

[4]俞林花, 聶緒強, 潘會君, 等. 白及多糖對糖尿病潰瘍創面愈合的作用研究[J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(11): 1487-1491.

[5]譚智昌. 活血化瘀法在創傷外科中的應用[J]. 山東中醫雜志, 1993, 12(6): 17-18.

[6]王耀霞, 徐立春. 莪術醇抗腫瘤研究進展[J]. 醫學綜述,2009, 15(22): 3483-3486．

[7]徐立春, 王耀霞, 陳海燕, 等. 莪術醇對SGC-7901細胞Akt、P-Akt及BAD表達水平影響的初步研究[J]. 醫學研究雜志, 2011, 40(12): 44-46.

[8]王恒, 王勇, 江曉霽, 等. 莪術醇通過JAK3/STAT信號途徑抑制Jurkat細胞增殖[J]. 第三軍醫大學學報, 2013, 12(5):21-23.

[9]田麗莉, 董建勇, 黃長江. 莪術醇對斑馬魚的血管生成活性及作用機制研究[J]. 中國中藥雜志, 2012, 37(12): 1822-1825.

[10]Al-Bayaty FH, Abdulla MA, Hassan MIA, et al. Effect of Andrographis paniculata leaf extract on wound healing in rats[J]. Nat Prod Res, 2012, 26(5): 423-429.

[11]Naoko FU, Ikuyo SA, Hirromi KO, et al. An extract of the root of Lithosermun erythrorhison accelerates wound healing in diabetic mice [J].Biol Pharm Bull, 2003, 2(3):329-335.

[12]Li S, Zhao J, Liu J, et al. Prospective randomized controlled study of a Chinese herbal medicine compound Tangzu Yuyang Ointment for chronic diabetic foot ulcers: A preliminary report[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 133(2): 543-550.

[13]Mendes JJ, Leandro CI, Bonaparte DP, et al. A rat model of diabetic wound infection for the evaluation of topical antimicrobial therapies[J]. Comparative Med, 2012, 62(1): 37-48.

[14]董芳, 蔡黔, 劉毅, 等. 糖尿病足潰瘍大鼠模型的建立[J].山東醫藥, 2010, 50(14): 34-35.

[15]代慶紅, 王忠東. 中國糖尿病的現狀調查[J]. 中國醫藥指南, 2011, 9(13): 206-208.

[16]葛奎, 陸樹良, 青春. 糖尿病難愈創面中血管生成遲滯的研究進展[J]. 中華創傷雜志, 2003, 19(10): 637-639.

[17]丁衛起.糖尿病皮膚創面難愈的機制研究進展[J]. 菏澤醫學專科學校學報, 2009, 21(3): 79-83.

[18]Dinh T, Veves A. Microcirculation of the diabetic foot[J].Curr Pharm Design, 2005, 11(18): 2301-2309.

[19]魏婷婷, 謝麗云, 管咪咪, 等. aFGF抗糖尿病潰瘍作用的研究進展[J]. 溫州醫學院學報, 2013, 43(7): 488-490.

[20]李鈺瓏, 吳旭, 張軍花, 等. 蛻皮甾酮軟膏對家兔創面愈合的影響[J]. 新鄉醫學院學報, 2008, 25(2): 116-118.

[21]Wu Y, Chen L, Scott PG, et al. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis[J]. Stem Cells, 2007, 25(10): 2648-2659.