秀麗線蟲mfn-1 RNAi通過依賴于ATFS-1途徑激活線粒體未折疊蛋白反應(yīng)

姚秀萍，陳思希，任亞光，周懷彬，呂建新

（溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實驗室，浙江 溫州 325035）

細(xì)胞在內(nèi)部或外界環(huán)境的不利刺激下引起蛋白穩(wěn)態(tài)失衡時會激活一系列的保護(hù)性反應(yīng)，具體到細(xì)胞內(nèi)的不同部位有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)、細(xì)胞質(zhì)未折疊蛋白反應(yīng)、線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（mtochondrial unfolded protein response，UPRmt）[1-6]。當(dāng)線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)受到影響時，細(xì)胞核基因編碼的定位于線粒體的分子伴侶HSP-6、HSP-60等的表達(dá)會上調(diào)，以使發(fā)生錯誤折疊的蛋白質(zhì)形成正確構(gòu)象并促進(jìn)新生蛋白質(zhì)的正確折疊，這一過程叫作UPRmt[7-9]。轉(zhuǎn)錄因子ATFS-1介導(dǎo)UPRmt信號通路，ATFS-1含有線粒體及細(xì)胞核定位序列，在正常條件下，ATFS-1進(jìn)入線粒體并被蛋白酶CLPP-1、LON-1等降解；在線粒體受到應(yīng)激時，如線粒體亞基被RNAi敲低等，ATFS-1進(jìn)入線粒體減少而進(jìn)入細(xì)胞核增多，從而激活下游基因如分子伴侶HSP-6、HSP-60等表達(dá)，即激活UPRmt[10-11]。線粒體膜蛋白HAF-1被認(rèn)為介導(dǎo)線粒體與細(xì)胞核之間的信號傳遞并參與UPRmt，然而最近發(fā)現(xiàn)clk-1的敲低通過HAF-1激活UPRmt，而nuo-6、cco-1等基因RNAi對UPRmt的激活則不依賴HAF-1[10，12-14]。

線粒體功能紊亂與人類許多疾病的發(fā)生有關(guān)，然而在線蟲及果蠅等低等生物中卻延緩衰老[15-17]。我們此前發(fā)現(xiàn)，敲低線蟲線粒體轉(zhuǎn)鐵蛋白MFN-1后顯著延長壽命[18]。現(xiàn)就mfn-1RNAi是否激活UPRmt及其激活的信號通路進(jìn)行研究，今后將進(jìn)一步驗證UPRmt的激活是否介導(dǎo)了mfn-1RNAi壽命延長。

1 材料和方法

1.1 材料 線蟲N2、SJ4058、SJ4100、TJ375、SJ4005、RB867、VC3201，大腸桿菌HT115（DE3）由Caenorhabditis genetics center（CGC）提供；質(zhì)粒L4440由本實驗室保存；LA Taq酶、DNA marker購自寶生物有限公司；異丙基硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素、鹽酸四環(huán)素鈉、瓊脂、蛋白胨、酵母提取液、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等試劑購自Sigma；其他材料為本實驗室保存。

1.2 SJ4058雄蟲的制備 將L4期SJ4058線蟲挑至鋪有HT115菌膜的板上，每板6條，共5個板，置于31 ℃熱激6 h，然后置于20 ℃培養(yǎng)。3～4 d后尋找F1代雄性線蟲（尾巴有突起狀），將其挑至新的HT115菌膜上，然后再挑入3條雌雄同體線蟲雜交，F(xiàn)2代可獲得大量SJ4058雄蟲。

1.3 SJ4058線蟲與VC3201線蟲的雜交 將SJ4058線蟲雄蟲20條與VC3201線蟲雌雄同體2條挑至同一個鋪有HT115菌膜的NGM板上（3.5 cm直徑小平皿）讓其交配產(chǎn)生F1代，將F1代雌雄同體線蟲2條轉(zhuǎn)到新的含菌膜NGM板上讓其產(chǎn)生F2代，挑取50條F2代分別于50個NGM平板上，每板1條并編號，待其產(chǎn)卵后，PCR鑒定F2代基因型，篩選出含atfs-1純合子及hsp-60::gfp線蟲（雜合或者純合），保留陽性的F2代平板，將每個陽性板上的F3線蟲取20條通過PCR鑒定hsp-60::gfp，若某個板上20條F3全能擴(kuò)增出目的基因，則該板很可能為純合子hsp-60::gfp，最后將篩選到的陽性線蟲品系傳一兩代后進(jìn)一步PCR驗證以確認(rèn)。所有PCR鑒定過程均以野生型N2線蟲為陰性對照，不加模板的為空白對照。鑒定hsp-60::gfp所用引物為：hsp-60::gfp上游（5’-CATTTTACCGCCTGA AATTC-3’），hsp-60::gfp下游（5’-CTTCCATCTTCAATGT TGTG-3’），鑒定atfs-1所用引物為：atfs-1上游（5’-TTTCAGTCGTTTCAGGACCC-3’），atfs-1下游（5’-TCATCGA GTTGATCTCACGC-3’）。PCR反應(yīng)條件為：dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）1.6 L，10×PCR buffer 1 L，上游引物0.2 L，下游引物0.2 L，LA Taq酶（5 U/ L）0.1 L，ddH2O 6.9 L，模板DNA 5 L，總體積為15 L。反應(yīng)條件：①94 ℃ 4 min；②94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共39個循環(huán)；③72 ℃20 min；④保持在4 ℃。取5 L PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 SJ4058線蟲與RB867線蟲雜交 方法類似，鑒定hsp-60::gfp用引物同上。鑒定haf-1引物為：haf-1上游（5’-CACCCCTGTCACAGACCTTT-3’），haf-1下游（5’-CGCCAGAGAACAACAGATGA-3’）。PCR反應(yīng)條件為：dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）1.6 L，10×PCR buffer 1 L，上游引物0.2 L，下游引物0.2 L，LA Taq酶（5 U/ L）0.1 L，ddH2O 6.9 L，模板DNA 5 L，總體積為15 L。反應(yīng)條件：①94 ℃ 4 min；②94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共39個循環(huán)；③72 ℃ 20 min；④保持在4 ℃。取5 L PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 秀麗線蟲mfn-1的RNA干擾 分別挑取含mfn-1干擾質(zhì)粒及空載l4440質(zhì)粒的HT115菌在3 mL液體LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素終濃度100 g/mL，四環(huán)素12.5 g/mL）中培養(yǎng)約10 h，再加入3 L 1 mol/L IPTG培養(yǎng)1 h，然后各取70 L菌液均勻涂于NGM平板（含氨芐青霉素終濃度100 g/mL，四環(huán)素12.5 g/mL，IPTG 238.3 g/mL），放于25 ℃誘導(dǎo)12～16 h。然后將L4期線蟲轉(zhuǎn)至菌膜上，3～4 d后，取F1代進(jìn)行各種指標(biāo)觀測。

1.6 倒置熒光顯微鏡觀測 配3%的瓊脂糖，加熱融化后滴1滴于載玻片，立即加上蓋玻片，使瓊脂糖形成硬幣大小的膜，然后移走蓋玻片。在瓊脂糖膜上滴1滴0.5%的左旋霉素麻醉劑，將同步化的mfn-1RNAi及空載l4440 RNAi處理F1代成蟲分別放到麻醉劑里，1 min后即可觀測熒光。在同樣的曝光條件及放大倍數(shù)下觀測熒光并拍照。

2 結(jié)果

2.1 將SJ4058線蟲分別與VC3201及RB867線蟲雜交后獲得基因型分別為hsp-60::gfp/atfs-1（gk3094）V及hsp-60::gfp/haf-1（ok705）IV的線蟲 首先通過熱激獲得了SJ4058雄性線蟲，將雄性SJ4058線蟲分別與雌雄同體VC3201及RB867線蟲雜交，通過前述方法雜交并PCR鑒定篩選到基因型為hsp-60::gfp/atfs-1（gk3094）V和hsp-60::gfp/haf-1（ok705）IV的線蟲，將該兩品系線蟲傳幾代后進(jìn)一步PCR確認(rèn)其基因型，成功獲得雜交的線蟲，如圖1-2所示。

圖1 PCR鑒定基因型為hsp-60::gfp/atfs-1(gk3094)V的雜交線蟲

圖2 PCR鑒定基因型為hsp-60::gfp/haf-1(ok705)IV的線蟲

2.2Mfn-1RNAi特異性激活UPRmt分別將線蟲SJ4058、SJ4100、TJ375、SJ4005的L4期幼蟲放在含mfn-1RNAi質(zhì)粒及l(fā)4440空載的HT115菌膜上進(jìn)行干擾，方法如前所述。然后將F2代線蟲在熒光倒置顯微鏡下觀測綠色熒光，根據(jù)觀測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mfn-1RNAi激活了線粒體的分子伴侶HSP-6及HSP-60的表達(dá)，而并沒激活細(xì)胞質(zhì)分子伴侶HSP-16.2及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶HSP-4的表達(dá)，如圖3所示。這表明mfn-1RNAi可能影響了線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，激活了線粒體的反饋性反應(yīng)，而細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)未受到明顯影響。

2.3Mfn-1RNAi對UPRmt的激活不依賴于線粒體膜蛋白HAF-1，而依賴于轉(zhuǎn)錄因子ATFS-1 為了驗證mfn-1RNAi通過什么通路激活UPRmt，我們構(gòu)建了基因型分別為hsp-60::gfp/atfs-1（gk3094）V及hsp-60::gfp/haf-1（ok705）IV線蟲，對該兩種線蟲進(jìn)行mfn-1RNAi處理后觀測熒光，并以L4440空載為對照，發(fā)現(xiàn)在atfs-1基因功能缺失線蟲中，HSP-60表達(dá)不能被激活，而haf-1基因功能缺失的線蟲中，HSP-60的表達(dá)仍然可以激活，如圖4所示。這說明mfn-1RNAi 對UPRmt的激活依賴于ATFS-1，而不依賴于HAF-1。

圖3 Mfn-1 RNAi特異性激活線粒體分子伴侶，而未激活細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶的表達(dá)（×100，200 ms）

圖4 Mfn-1 RNAi對HSP-60表達(dá)的激活依賴于ATFS-1，而不依賴于HAF-1（×100，200 ms）

3 討論

線粒體是ATP合成、三羧酸循環(huán)、鐵硫簇及血紅素合成的主要場所[19-21]。線粒體功能紊亂與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如線粒體儲鐵蛋白frataxin突變引起弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)，鐵硫簇組裝支架蛋白iscu突變引起肌病（myopathy）等[22]。在線蟲中卻發(fā)現(xiàn)許多呼吸鏈亞基突變可以延長壽命，某些保護(hù)性機(jī)制的激活被認(rèn)為促進(jìn)了長壽，主要有自噬、UPRmt、蛋白質(zhì)翻譯速率降低等[17，23]。深入研究這些機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)線粒體疾病的新治療方法。

MFN-1是線粒體轉(zhuǎn)鐵蛋白，我們在此前的研究中發(fā)現(xiàn)mfn-1RNAi后引起線蟲體型變小，繁殖力下降，然而壽命卻顯著延長[18]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)mfn-1RNAi激活了UPRmt，而對細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性的未折疊蛋白反應(yīng)則沒有激活。這提示mfn-1RNAi影響了線粒體功能或蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，而對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞質(zhì)蛋白穩(wěn)態(tài)影響不大。我們將hsp-60::gfp轉(zhuǎn)基因線蟲SJ4058與atfs-1基因功能缺失線蟲VC3201雜交，發(fā)現(xiàn)當(dāng)atfs-1缺失時，UPRmt不能再被激活。這說明mfn-1RNAi對UPRmt的激活依賴于ATFS-1。采用同樣的方法，發(fā)現(xiàn)mfn-1RNAi對UPRmt的激活不依賴于線粒體膜蛋白HAF-1。這也與文獻(xiàn)報道一致，如ISP-1、NUO-6等大部分定位于線粒體的蛋白表達(dá)降低對UPRmt的激活也不依賴于HAF-1[10，13，24]。本研究有助于繼續(xù)探索UPRmt的激活是否與mfn-1RNAi延長壽命有關(guān)。

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