直腸癌HIF-1α和COX-2的表達與新輔助放化療敏感性的相關性

徐昶，宋華羽，左志貴，厲金雷，蔡劍輝，吳祥斌

（溫州醫科大學附屬第一醫院 肛腸外科，浙江 溫州 325015）

近年來，術前新輔助放化療在中低位直腸癌治療中的價值已經得到公認，但是約有30%的患者對放化療不敏感，因此，尋找預測放化療敏感性的指標成為研究的新熱點。近期研究認為腫瘤低氧不僅與腫瘤的侵襲表型相關，還可導致腫瘤細胞對放射線敏感性降低，并促進多藥耐藥基因表達，使腫瘤細胞產生放化療抵抗[1-2]。低氧誘導因子1-α（hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α）是唯一的特異性低氧狀態下發揮活性的轉錄因子，環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是HIF-1α的下游調控基因。本研究探討直腸癌中HIF-1α及COX-2的表達水平對新輔助放化療敏感性的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集本院2008年4月至2013年3月局部進展期直腸癌患者行新輔助放化療前的活檢標本45例，男31例，女14例，年齡41～69歲，平均（59.9±7.8）歲。腫瘤下緣距離肛門2～8 cm。根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯盟（UICC）結直腸癌TNM分期系統（第七版）進行臨床T和N分期，采用3.0T MRI進行評估。TNM II期22例，TNM III期23例。T3 34例，T4 11例。患者均接受術前新輔助放化療并簽署知情同意書。本研究得到本院倫理委員會同意。

1.2 治療方法 新輔助放化療方案為卡培他濱825 mg/m2，每天2次，連續服用2周休息1周，共2個療程。放射治療采用標準的盆腔野照射，Dt 50 Gy/25次，照射野包括腫瘤原發灶和區域淋巴結。放療結束后第6周接受手術治療。

1.3 試劑和檢測方法 一抗HIF-1α和COX-2均購自北京博奧森生物技術有限公司。兔二抗、DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋試劑公司。已知的HIF-1α、COX-2陽性的乳腺癌組織切片為陽性對照。以PBS代替一抗作為陰性對照。切片脫蠟去水，0.1%枸櫞酸修復抗原，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復染、脫水、封片。

1.4 免疫組織化學結果判定 HIF-1α按照Birner等[3]采用的方法，以腫瘤細胞胞核或胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞，綜合染色強度和陽性細胞占總細胞數的百分比進行半定量處理。染色強度的評分標準：1分：弱染色但強于陰性對照；2分：中度染色；3分：強染色。陽性細胞數占總細胞數的百分比的評分標準：0分：＜l%；1分：l%～lO%；2分：11%～50%；3分：51%～80%；4分：＞81%。上述評分結果兩項相加，1～3分為低表達；4～7分為高表達。COX-2結果判定標準同上。同時量化HIF-1α和COX-2的表達水平：選擇相同的參數，每個標本于癌巢隨機選取5個不重復的視野拍照。利用Imagepro plus 6.0圖像分析系統檢測每張照片中腫瘤細胞的光密度值，取平均光密度（mean optical density，MOD）作為該例標本的表達水平。

1.5 新輔助放化療效果評估方法 判斷T分期降期：依據術前影像學臨床分期，對比病理檢查后的T分期，判斷是否發生了T分期的改變。手術標本由2位病理科醫師檢查閱片。腫瘤消退反應的評判標準參照改良Wheeler直腸癌消退分級（modified rectal cancer regression grade，mRCRG）[4]進行評定：mRCRG I級：肉眼見病理特征改變，鏡下未見腫瘤細胞或腫瘤細胞癌巢少于5%，可以有黏液池存在，但是不含有腫瘤細胞；mRCRG II級：肉眼見病理特征改變，鏡下見腫瘤細胞與纖維組織混合，腫瘤細胞占5%～50%；mRCRG III級：肉眼及鏡下未見明顯放療后病理特征改變，腫瘤細胞超過50%，僅有一些類似于普通結締組織增生的纖維化組織。

1.6 統計學處理方法 所有數據采用SPSS 13．0統計軟件進行統計學分析。采用卡方檢驗及連續校正卡方檢驗分析HIF-1α和COX-2表達與直腸癌臨床特征及新輔助放化療效果的關系；采用Spearman等級相關分析HIF-1α與COX-2表達的相關性。P＜0．O5為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療結果 45例患者全部完成術前新輔助放化療。21例患者出現局部放射性皮炎、惡心、嘔吐、骨髓抑制等不良反應，經對癥治療好轉。36例接受保肛術，9例接受經腹會陰聯合切除術。新輔助放化療后的手術標本鏡下可見腫瘤細胞纖維化（見圖1）。腫瘤細胞消退達到mRCRG I級14例（占31.1%），mRCRG II級22例（占48.9%），mRCRG III級9例（占20.0%）。術后T分期降期22例（占48.9%），T分期未降期23例（占51.1%），其中3例（占6.7%）出現T分期進展，由T3進展至T4。隨訪時間9～68個月，平均（28.5±13.5）月，無失訪病例，無局部復發病例。遠處轉移7例，分別為4例肝轉移，2例腹膜后淋巴結廣泛轉移，1例肺轉移。

2.2 HIF-1α和COX-2表達與直腸癌臨床特征的關系 在新輔助放化療前直腸癌活檢組織標本中HIF-1α表達率為73.3%，表達在腫瘤細胞核和細胞漿（見圖2）；COX-2表達率為82.2%，主要表達在腫瘤細胞的細胞漿（見圖3）。新輔助放化療前直腸癌活檢標本中COX-2高表達組腫瘤直徑≥5 cm的患者占70.8%，高于低表達組（為28.6%），差異有統計學意義（P＜0.05）。性別、年齡、臨床T分期、是否遠處轉移與HIF-1α及COX-2的表達量均無關（P＞0.05）（見表1）。

2.3 HIF-1α和COX-2表達與直腸癌新輔助放化療效果的關系 新輔助放化療前直腸癌活檢組織中HIF-1α低表達組有50.0%患者在放化療后腫瘤消退達到mRCRG I級，而高表達組僅有16.0%達到mRCRG I級，差異有統計學意義（P＜0.05）。HIF-1α低表達組在放化療后T分期降期率為70.0%，高表達組為32.0%，兩者相比差異有統計學意義（P＜0.05）。COX-2表達水平與mRCRG腫瘤消退等級及T分期降期無關（均P＞0.05）（見表1）。

圖1 新輔助放化療后少許殘留的癌細胞伴纖維組織增生（HE，×200）

圖2 HIF-1α在直腸癌組織中的表達（SP法，×400）

圖3 COX-2在直腸癌組織中的表達（SP法，×400）

表1 HIF-1α和COX-2表達與直腸癌臨床特征及新輔助放化療療效的關系

2.4 直腸癌組織中HIF-1α與COX-2表達的相關性采用光密度值量化新輔助放化療前直腸癌組織中HIF-1α和COX-2的表達水平，Spearman等級相關分析結果顯示兩者表達呈低度正相關（r=0.36，P=0.015）。

3 討論

低氧誘導因子1（HIF-1）是腫瘤細胞在低氧環境下激活的主要轉錄因子，HIF-1α是HIF-l的功能亞基，其調控的下游基因所編碼的蛋白功能中，最主要的是對腫瘤血管生成和能量代謝的調控，并通過促進腫瘤血管生成降低放射敏感性[1]。Kaidi等[5]報道了在低氧的結直腸癌細胞中，HIF-1直接與COX-2啟動子中位于-506位點的低氧誘導應答元件相結合，促進COX-2的表達，使PGE合成增加。低氧條件下HIF-1與COX-2/PGE2之間存在正反饋環路，COX-2/PGE2上調一旦觸動會不斷放大HIF-1作用，調節其他HIF-1的靶向基因，同時維持COX-2的高水平，促進腫瘤細胞對低氧的適應，從而促進腫瘤的生存和轉移。

研究發現HIF-1α在一系列人類腫瘤中呈高表達，其表達水平隨著微環境氧濃度的改變而改變，與頭頸部癌、宮頸癌、前列腺癌、胃癌等腫瘤轉移能力、對放化療的抵抗直接相關[1，6]。目前對HIF-1α與直腸癌新輔助放化療關系的研究較少。已經發表的文獻[7]認為放療前HIF-1α表達水平與放療后腫瘤退縮程度無關，這與HIF-1α在其他腫瘤放化療中的研究結果相悖。原因可能在于作者采用的放療后腫瘤退縮評判標準并不適用于評價直腸癌新輔助放化療的效果。在評估直腸癌放化療療效的研究中，部分學者提出了“近完全緩解”的概念，認為完全緩解和近完全緩解可以獲得很好的預后，無病生存率和總生存率都得到提高，這對直腸腫瘤預后的預測和治療更有指導意義[8-9]。我們采用改良Wheeler體系（mRCRG），以是否達到腫瘤細胞消退95%以上為標準來評判新輔助放化療的反應性，結果發現HIF-1α的表達高低與放化療后腫瘤細胞消退程度密切相關，同時HIF-1α的表達水平與腫瘤T分期降期亦密切相關。HIF-1α高表達組新輔助放化療反應性差，而低表達組可以獲得較好的新輔助放化療反應。原因可能在于HIF-1α調控某些參與DNA修復過程的因子表達，放療時使電離輻射對腫瘤細胞DNA的損傷無法固定，并通過促進無氧代謝使殘留的腫瘤細胞獲得必要的生存條件。HIF-1α通過抗凋亡、上調血管內皮生長因子（VEGF），促進腫瘤血管生成而降低放射敏感性[1，10]。

盡管臨床前期研究顯示選擇性COX-2抑制劑能顯著增強腫瘤對放療的反應性[11]，而且體內外試驗也都支持這種觀點，但是來自人體直腸癌治療的研究數據仍然較少。我們的研究結果顯示COX-2的表達水平與腫瘤消退程度或T分期降期均無關，這與Bouzourene等[12]的研究結果相一致，他們發現COX-2的表達與腫瘤的炎癥反應相關，而與放療敏感性并無相關。Kim等[13]也對包括COX-2和survivin在內的7個分子標志物做了直腸癌新輔助放化療敏感性預測分析，僅有survivin的高表達與腫瘤降期相關，而包括COX-2在內的其他指標都與降期無關。此外，我們的研究結果也顯示HIF-1α和COX-2在直腸癌組織中的表達水平只呈現低度正相關，這或許從另一方面提示在低氧的腫瘤中COX-2雖然是HIF-1α的下游調控基因，但是COX-2與HIF-1α可能通過多個未知的靶點在腫瘤中相互調節，COX-2在直腸癌放化療的敏感性中扮演更加復雜的角色，需要進一步的研究來深入闡明HIF-1α和COX-2互相作用的內在機制。

綜上所述，新輔助治療前直腸癌組織HIF-1α的表達水平可能成為預測放化療后腫瘤退縮和T分期降期的敏感性指標。影響直腸癌新輔助放化療療效的因素是多方面的，每個因素的變動都有可能對敏感性預測因子的判斷產生影響。選用對臨床具有指導意義的判斷標準，通過嚴格的臨床試驗設計，才能最終找到敏感性和特異性好的預測因子。

[1]Meijer TW, Kaanders JH, Span PN, et al. Targeting hypoxia, HIF-1, and tumor glucose metabolism to improve radiotherapy efficacy[J].Clin Cancer Res, 2012, 18(20): 5585-5594

[2]Ding Z, Yang L, Xie X, et al. Expression and signifi cance of hypoxia-inducible factor-1 alpha and MDR1/P-glycoprotein in human colon carcinoma tissue and cells[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2010, 136(11): 1697-1707.

[3]Birner P, Schindl M, Obermair A, et a1. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1 alpha is a marker for an unfavorable prognosis in early-stage invasive cervical cancer[J].Cancer Res, 2000, 60(17): 4693-4699.

[4]Bateman AC, Jaynes E, Bateman AR. Rectal cancer staging post neoadjuvant therapy-how should the changes be assessed?[J]. Histopathology, 2009, 54(6): 713-721.

[5]Kaidi A, Qualtrough D, Williams AC, et a1. Direct transcriptional up-regulation of cyclooxygenase-2 by hypoxia-inducible factor (HIF) -l promotes colorectal tumor cell survival and enhances HIF-1 transcriptional activity during hypoxia[J].Cancer Res, 2006, 66(13): 6683-6691.

[6]倪仲琳, 鄭志強, 趙亞新. HIF-1α在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 溫州醫學院學報, 2006, 36(3): 237-239.

[7]Havelund BM, S?rensen FB, Lindebjerg J. Pretreatment HIF-1α and GLUT-1 expressions do not correlate with outcome after preoperative chemoradiotherapy in rectal cancer[J]. Anticancer Res, 2011, 31(5): 1559-1565.

[8]Guillem JG, Chessin DB, Cohen AM, et al. Long-term oncologic outcome following preoperative combined modality therapy and total mesorectal excision of locally advanced rectal cancer[J]. Ann Surg, 2005, 241(5): 829-836.

[9]Das P, Skibber JM, Rodriguez-Bigas MA, et al. Predictors of tumor response and downstaging in patients who receive preoperative chemoradiation for rectal cancer[J]. Cancer,2007, 109(9): 1750-1759.

[10]Nakano T, Ohno T, Ishikawa H, et a1. Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer[J]. J Radiat Res, 2010, 51(1): l-8.

[11]Kim YM, Shin YK, Jun HJ, et al. Systematic analyses of genes associated with radiosensitizing effect by celecoxib, a specifi c cyclooxygenase-2 inhibitor[J]. J Radiat Res, 2011,52(6): 752-765.

[12]Bouzourene H, Yan P, Sandmeier D, et al. The role of COX-2 in rectal cancer treated with preoperative radiotherapy[J].Virchows Arch, 2008, 452(5): 499-505.

[13]Kim K, Chie EK, Wu HG, et al. High survivin expression as a predictor of poor response to preoperative chemoradiotherapy in locally advanced rectal cancer[J]. Int J Colorectal Dis, 2011, 26(8): 1019-1023.