人鈉/碘轉運體基因轉染結腸癌SW480細胞介導放射性碘治療的實驗研究

杜凡，周佰林，張紅征，李煥斌，文正偉，王玲，張琦

（溫州醫科大學 核醫學教研室，浙江 溫州 325035）

隨著DNA重組和基因轉移技術的逐步成熟，鈉/碘轉運體（sodium/iodide symporter，NIS）作為人類腫瘤的一種治療基因，被廣泛地轉染到多種腫瘤細胞中，如甲狀腺髓樣癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌等[1-4]，并成功地使轉染的腫瘤細胞具有攝碘功能。擴展碘131（131I）在非甲狀腺癌中的治療是NIS最具前景的研究領域之一。我們設想將轉基因技術與放射性核素治療相結合，將人鈉/碘轉運體（hNIS）基因轉染至人結腸癌SW480細胞中，使SW480細胞獲取攝131I能力，然后利用131I的輻射生物效應，達到殺傷腫瘤細胞的目的，即研究131I應用于結腸癌治療的可能性，為下一步的動物體內實驗提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞： SW480細胞購于上海中科院細胞庫；已轉染空白質粒（pcDNA3.1+）的SW480細胞和已轉染hNIS基因（pcDNA3.1+-hNIS）的SW480細胞，由溫州醫科大學核醫學教研室轉染并檢測[5]。

1.1.2 主要試劑：131I購于中國原子高科有限公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于凱基生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組：將細胞分為重組質粒（pcDNA3.1+-hNIS）轉染組（轉染組）、空白質粒（pcDNA3.1+）轉染組（空白質粒組）和空白對照組。以10%血清1640培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，長滿培養瓶85%～90%時傳代。

1.2.2 體外攝131I實驗：①用λ計數器測各組細胞本身的cpm值，即本底值。②6孔板培養各組SW480細胞24 h，每孔加含有15μCi131I的培養基1 mL，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。測24 h的瞬時攝131I率。③6孔板培養各組SW480細胞，分別于4、8、16、24、36、48 h用胰酶消化提取細胞測cpm值。④同時保留一管含有15μCi培養液1 mL，λ計數器測它不同時段的cpm值。測不同時段攝131I能力變化。

1.2.3 高氯酸鹽抑制實驗：各組SW480細胞均勻接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，長至約80%融合時，其中3個孔加入20μL的l mmol/mL NaClO4，另3個孔不加NaClO4，每孔加入含有15μCi131I的10%血清1640培養基，培養24 h時，消化提取細胞，測cpm值。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況：各組SW480細胞均勻接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，長至約80%融合時，換新培養基，每1 mL含100μCi的131I。各組細胞8、16和24 h用不含EDTA的胰酶消化收集1×105細胞，加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞，加5μL Annexin V-FITC/PI混勻后加入5μL Propidum Iodide，混勻。室溫下避光反應5～15 mim。流式細胞儀檢測觀察131I誘導各組細胞凋亡情況。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS12.0統計軟件。各組實驗數據均采用±s表示，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 質粒轉染SW480細胞24 h攝131I能力 轉染組比空白質粒組與空白對照組攝131I能力增加約8倍（P＜0.05），而空白質粒組與空白對照組攝131I能力差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 質粒轉染SW480細胞各時段攝131I能力曲線轉染組細胞4～24 h攝131I能力呈增高趨勢，24 h攝131I達高峰，24～48 h攝131I能力緩慢遞減。而空白對照組與空白質粒組各時段攝131I能力未見顯著變化。見圖1。

表1 質粒轉染SW480細胞后24 h攝131I能力（±s，cpm）

表1 質粒轉染SW480細胞后24 h攝131I能力（±s，cpm）

與空白對照組比：aP＜0.05；與空白質粒組比：bP＜0.05

組別 每分鐘放射性計數轉染組 2 915.34±972.91ab空白質粒組 348.44±92.79空白對照組 333.0±100.86

圖1 SW480細胞不同時段攝131I能力曲線圖

2.3 測定穩定表達hNIS-SW480細胞NaClO4抑制情況 未加NaClO4轉染組攝131I能力明顯增加，加NaClO4轉染組攝131I能力明顯受抑制，攝131I能力降低為前者的1/10左右（P＜0.05）。而空白質粒組與空白對照組加與未加NaClO4攝131I能力差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 穩定轉染細胞系NaClO4抑制實驗（±s，cpm）

表2 穩定轉染細胞系NaClO4抑制實驗（±s，cpm）

與同組加NaClO4比：aP＜0.05

組別 加NaClO4 未加NaClO4轉染組 315.70±66.30 3 304.60±340.60a空白質粒組 336.80±50.60 309.95±33.14空白對照組 310.70±32.05 339.35±51.28

2.4 流式細胞儀分析各組細胞凋亡情況 使用Annexin V-FITC/PI雙染行流式細胞儀檢測分析100 μCi131I殺傷下各組細胞凋亡情況，結果顯示轉染組16 h出現明顯的早期凋亡，凋亡率達14.7%；而24 h晚期凋亡顯著增加，凋亡率達32.9%，轉染組凋亡率顯著高于空白質粒組與空白對照組。見圖2。

3 討論

擴展放射性碘在非甲狀腺癌中的治療是NIS最具前景的研究領域。hNIS作為一種腫瘤治療基因，研究其靶向特異性并作為精確調控的基因載體治療腫瘤具有一定優勢，即為腫瘤治療開辟新途徑。已有研究報道將hNIS基因轉染至非甲狀腺腫瘤細胞使其成功表達hNIS獲得攝取131I的能力，利用131I的放射性生物殺傷作用達到殺傷腫瘤細胞的療效[6-7]。

本實驗檢測了hNIS-SW480細胞的攝131I能力和殺傷作用，結果顯示篩選穩定hNIS-SW480細胞后其24 h攝131I能力比空白對照組與空白質粒組增高約8倍（P＜0.05），而空白質粒組與空白對照組攝131I能力未見明顯變化（P＞0.05），表明轉染入hNIS基因的SW480細胞具有高度濃聚碘的能力。高氯酸鹽和碘離子均易被hNIS轉運至細胞內，而前者更易被攝取，故給予細胞高氯酸鹽能競爭性地將碘離子排出細胞外。但在正常甲狀腺細胞中碘離子在碘化酶的作用下與甲狀腺球蛋白結合轉化成碘化甲狀腺球蛋白，則不會自細胞被釋放。本實驗中hNIS-SW480細胞轉染了hNIS基因，僅能攝取131I而沒有碘化酶基因的作用，所以當高氯酸鹽存在時，碘離子會被排出細胞。高氯酸鹽抑制實驗結果表明hNIS-SW480細胞攝131I能力為hNIS基因的功能；未加NaClO4轉染組攝131I能力明顯增加，加NaClO4轉染組攝131I能力明顯受抑制，攝131I能力降低為前者的1/10左右（P＜0.05），而空白質粒組與空白對照組加與未加NaClO4比攝131I能力差異均無統計學意義（P＞0.05），進一步證明NIS的功能是濃聚碘。Annexin V-FITC/PI雙染行流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，在100μCi131I殺傷作用下，轉染組16 h出現明顯的早期凋亡，凋亡率達14.7%；而24 h晚期凋亡顯著增加，凋亡率達32.9%，轉染組凋亡率顯著高于空白質粒組與空白對照組。

綜上所述，結腸癌SW480細胞轉染hNIS具有顯著的攝131I功能，且131I對轉染入hNIS基因的SW480細胞具有顯著殺傷效果。盡管關于NIS的研究已經取得顯著成果，但NIS的靶向作用、表達程度、在腫瘤細胞中的分布等一系列問題還需進一步探索。

圖2 3組在100μCi 131I作用下不同時間凋亡率（Q1：壞死細胞；Q2：晚期凋亡細胞；Q3：存活細胞；Q4：早期凋亡細胞）

[1]Shimura H, Haraguchi K, Miyazaki A, et al. Iodide uptake and experimental 131I therapy in transplanted undifferentiated thyroid cancer cells expressing the Na+/I- symporter gene[J]. Endocrinology, 1997, 138(10): 4493-4496.

[2]周泉波, 陳汝福, 李志花, 等. 重組pDC316-MCMV/hNIS真核表達質粒的構建及在腫瘤細胞的功能[J]. 中山大學學報, 2007, 28(4): 383-386, 407

[3]Dohán O, Baloch Z, Bánrévi Z, et al. Rapid communication:predominant intracellular overexpression of the Na(+)/I(-)symporter (NIS) in a large sampling of thyroid cancer cases[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86(6): 2697-2700.

[4]Cengic N, Baker CH, Schutz M, et al. A novel therapeutic strategy for medullary thyroid cancer based on radioiodine therapy following tissue-specifi c sodium iodide symporter gene expression[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2005,90(8): 4457-4464.

[5]周佰林, 張琦, 張紅征, 等. 人鈉/碘轉運體基因轉染結腸癌SW480細胞及相關蛋白表達的檢測[J]. 浙江醫學, 2013,35(12): 1120-1122, 1126.

[6]Faivre J, Clerc J, Gerolami R, et al. Long-term radioiodine retention and regression of liver cancer after sodium iodide symporter gene transfer in wistar rats[J]. Cancer Res, 2004,64(21): 8045-8051.

[7]Dwyer RM, Bergert ER, O’Connor MK, et al. In vivo radioiodide imaging and treatment of breast cancer xenografts after MUC1-driven expression of the sodium iodide symporter [J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(4): 1483-1489.