抗癌防移片對4T1小鼠乳腺癌影響的研究

侯 超，胡志希*，曾柏榮，李 琳，陳龍嬌

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510000）

抗癌防移片對4T1小鼠乳腺癌影響的研究

侯 超1，胡志希1*，曾柏榮2，李 琳1，陳龍嬌3

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510000）

目的 觀察抗癌防移片對4T1小鼠乳腺癌的影響。方法 建立4T1乳腺癌小鼠模型，隨機分為空白對照組、模型組、環磷酰胺組和抗癌防移片組，分別給予藥物或生理鹽水，動態觀察給藥期間小鼠生活狀況。給藥4周后處死小鼠，測定小鼠體質量增加百分數，測量剝離瘤體積，計算瘤體積抑制率以及計數肺轉移瘤灶個數。結果 與模型組比較，抗癌防移片組小鼠腫瘤生長緩慢，肺轉移瘤灶數量明顯減少（P＜0.05）；與環磷酰胺組比較，抗癌防移片組藥物毒副作用小（P＜0.05），生活質量高，但其抑瘤防轉移作用不及環磷酰胺（P＜0.05）。結論 抗癌防移片能抑制4T1小鼠乳腺癌生長與轉移，改善小鼠生存質量。

抗癌防移片；4T1小鼠乳腺癌；腫瘤體積；瘤體積抑制率；肺轉移瘤灶數

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，復發與轉移是導致女性患者死亡的主要原因。研究證實，25%以上的乳腺癌一開始即發生血行遠處轉移，而通過淋巴道轉移途徑的機會則更多[1]。目前臨床上防治乳腺癌復發與轉移，主要采用化療與內分泌治療，但由于藥物的毒副反應和耐藥性，嚴重影響了治療的效果。而抗腫瘤中藥由于作用的多靶向性、毒副作用低且價廉，越來越受到患者的歡迎。

抗癌防移片系曾柏榮教授有效驗方，以扶正祛邪為基本治則，調補肝脾、行氣活血、祛痰化濕為治療大法，用于臨床防治乳腺癌術后復發與轉移，收效明顯[2]。為了證實該復方制劑的療效并為其臨床應用提供實驗依據，我們觀察了抗癌防移片對BALB/c小鼠4T1乳腺癌移植瘤模型的抑瘤防移效果及其毒副作用，現將方法與結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試藥物 抗癌防移片由紅參、半枝蓮、黃芪、姜黃、重樓等16味中藥組成，湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供。批號：20130521，規格：0.3 g/片，100片/瓶，每片含生藥0.47 g；注射用環磷酰胺購于江蘇恒瑞醫藥股份有有限公司，批號：201300830，規格：100 mg/瓶。

1.1.2 動物及瘤株 BALB/c小鼠48只，雌性，6～8周齡，體質量18～20 g，SPF級，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK9(湘)2011-0003；自發轉移性乳腺癌4T1細胞株，由湘雅醫學院細胞培養室提供。

1.1.3 主要儀器 細胞培養超凈工作臺，廠家：美國Nuaire，型號：NV-425-400E；水套式C02培養箱，廠家：美國Shellab,型號：2406-2；倒置生物顯微鏡：廠家：南京江南光電股份有限公司，型號：XD-101。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及分組 參照文獻方法進行造模[3]。將4T1乳腺癌細胞置于37℃和5%CO2充分濕化條件下用完全培養基培養并傳代，取生長良好的細胞經胰酶消化后，將細胞濃度調整至1×106個/mL，隨機取36只小鼠，于右側第二乳頭脂肪墊皮下注射瘤細胞數為2×105個/只。待腫瘤體積生長到直徑約5 mm左右時，隨機分為抗癌防移片組、環磷酰胺組與模型組，余12只未接種瘤細胞懸液小鼠作為空白對照組。

1.2.2 給藥方法 小鼠每日以藥液或生理鹽水灌胃，同時每2日以藥液或等體積生理鹽水腹腔注射。給藥劑量按人鼠體表面積折算法計算[4]，抗癌防移片組生藥量為5.2 g/(kg·d)，每日予抗癌防移片懸濁液灌胃，同時每2日予生理鹽水腹腔注射；環磷酰胺組每2日予環磷酰胺0.04 g/(kg·d)腹腔注射，同時予生理鹽水灌胃；模型組與空白對照組予生理鹽水灌胃，每2日予生理鹽水腹腔注射，連續給藥4周。

1.2.3 實驗標本取材 末次給藥結束后，次日清晨，稱量體質量，脫頸處死小鼠，摘除腫瘤，剔除筋膜，切取部分瘤組織，切取體積約為 0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm （取材時避開瘤體中央液化壞死區與瘤體外周）后加入20%多聚甲醛固定，備行病理切片及免疫組化檢測；開胸取肺臟，投入到Boains固定液（飽和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸=75∶25∶5）中固定24 h后，用無水乙醇沖洗至肺組織顏色恢復。

1.3 檢測指標

1.3.1 瘤體積與瘤體積抑制率 給藥結束后，處死小鼠，完整剝離接種部位腫瘤，游標卡尺測量并計算瘤體積（VT）。計算公式為：VT=(a×b2)/2，a為腫瘤最長徑，b為垂直于最長徑的最大橫徑[5]。計算各組瘤體積抑制率公式：瘤體積抑制率（%）=（模型組平均瘤體積-治療組平均瘤體積）/模型組平均瘤體積×100%[5]。

1.3.2 肺轉移結節數與肺轉移抑制率 處死小鼠后，開胸取出肺臟，將肺組織于Bouins固定液中固定24 h，再用無水乙醇浸泡至肺組織恢復顏色，攝像頭放大鏡下計數全肺結節數目。肺轉移抑制率（%）=（模型組平均肺表面轉移結節數-治療組平均肺表面轉移結節數）/模型組平均肺轉移結節數× 100%。

1.3.3 生存質量與體質量增加率 給藥期間，觀察小鼠皮毛光澤度、活動靈活度；稱得給藥前和結束后體質量，體質量增加率=(實驗結束后體質量-實驗前體質量)/實驗前體質量×100%，評估其營養改變情況。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠瘤體積與抑制率比較

空白對照組無腫瘤生長，與模型組比較，環磷酰胺組、抗癌防移片組剝離瘤體積縮小（P＜0.05）；抗癌防移片組剝離瘤體積大于環磷酰胺組 （P＜0.05）；抗癌防移片的瘤體積抑制率為35.68%，低于環磷酰胺組的70.13%。見表1。

表1 各組瘤體積與抑制率的比較

2.3 各組小鼠肺轉移結節數與肺轉移抑制率比較

與模型組比較，抗癌防移片組肺轉移結節數顯著減少（P＜0.05），多于環磷酰胺組（P＜0.05）。結果見表2，圖1。

2.4 生存質量與體質量增加率比較

與模型組及環磷酰胺組比較，抗癌防移片組小鼠皮毛光澤，活動靈活，體質量增加率顯著提高（P＜ 0.05）；與模型組比較，環磷酰胺組小鼠見皮毛欠光澤、反應遲鈍、行動遲緩等毒副作用，體質量增加率有降低趨勢（P＞0.05）。結果見表3。

表2 各組肺轉移結節數及肺轉移抑制率的比較

圖1 各組小鼠肺組織轉移瘤結節攝像放大圖（×15）

表3 3組小鼠體質量增加百分率的比較

3 討論

乳腺癌是危害婦女身心健康的重大疾病，目前以手術治療為主，化療、放療為輔。近年來，乳腺癌的化療已逐漸成為術后輔助治療的首選方式，但由于化療藥物的濫用和腫瘤本身的異質性或其他原因，越來越多的腫瘤耐藥性報道給乳腺癌的化療帶來很大挑戰[6]。研究者們指出，化療是否有效取決于癌細胞對化療藥物是否產生耐藥性[7]。此外，乳腺癌化療藥物如紫杉醇、氟尿嘧啶的毒副反應也限制了其臨床應用的普及[8]。目前，越來越多的腫瘤醫家們將目光投向了多靶向性、毒副作用低且價廉的抗腫瘤中藥研發。

中醫學認為，乳腺腫瘤屬“乳巖”、“乳石癰”等范疇，主要由正氣虧虛、臟腑陰陽失調引發。《醫宗必讀》載：“積之成也，正氣不足，而后邪氣居之”。《醫宗金鑒》云：“乳癌由肝脾兩傷，氣郁凝結而成”。中醫學認為，影響乳癌等腫瘤復發、轉移的關鍵因素是“伏邪”、“余毒”，腫瘤晚期或術后患者正氣虧虛，潛伏之癌毒易乘虛而入，入絡傷血，煎灼津液，致痰、毒、瘀互結，侵蝕脈道，最終導致癌癥的復發與轉移[9]。《瘟疫論》述：“若無故復發者，以伏邪未盡”。總之，乳癌屬本虛標實之病，以肝脾虛弱、沖任失調為本，氣滯血瘀、熱毒蘊結、痰凝濕困為標，治療上固本以補益肝脾、調補沖任為主，祛邪以行氣活血、清熱解毒、化痰祛濕為綱。基于這一處方思路，湖南中醫藥大學附屬第一醫院腫瘤科結合臨床乳巖處方經驗，研制出了抗癌防移片這一有效驗方，該方由紅參、黃芪、半枝蓮、重樓、姜黃、莪術等16味中藥組成，方中紅參大補元氣、養血安神，半枝蓮清熱解毒、散瘀定痛。紅參得半枝蓮竣補而不助邪，半枝蓮得紅參清解而不傷正，共為君藥。臣以黃芪、女貞子、墨旱蓮與枸杞子益氣健脾、補益肝腎，白術、湘曲健脾開胃以增強紅參補益之功，薏苡仁健脾祛濕、清熱排膿，姜黃、莪術及九香蟲行氣化瘀以助半枝蓮祛除病邪。綜觀全方，諸藥大都歸于肝、脾二經，使得濕熱瘀毒得清，先天、后天之本得固，標本同治，符合腫瘤的治療原則，臨床上用于控制乳腺癌術后復發與轉移，獲得了可喜的療效[2]。

本次研究通過皮下接種4T1乳腺癌細胞懸液成功建立BALB/c乳腺癌小鼠模型，觀察了抗癌防移片對該模型抑瘤抗轉移及改善生存質量的效應。結果顯示：抗癌防移片組接種部位腫瘤體積較模型組顯著縮小，乳腺癌肺轉移瘤結節數較模型組也明顯減少，與模型組比較，抗癌防移片組小鼠生活質量改善，體質量明顯增加（6.58%VS 2.89%），差異均有統計學意義，證實了該復方既有抑制4T1小鼠乳腺癌生長與向肺部轉移的作用，同時也能一定程度上增加小鼠體質量，改善小鼠生存質量，為抗癌防移片用于臨床乳腺癌的治療提供了依據。現代藥理研究已證實，抗癌防移片組成藥物如紅參、半枝蓮、黃芪、薏苡仁等所含的有效化學組分可通過調節免疫、抗血管生成、等多途徑、多靶點發揮抗腫瘤的功效。如紅參經由人參加工而來，與人參相比，增加了次生皂苷（ginsenoside-Rh2，由某些二醇組皂苷受熱降解后生成）等特有成分，抑制腫瘤新生血管的形成作用明顯提高[10]；半枝蓮的抗腫瘤作用，也是通過主要成分黃酮類化合物、二萜類化合物等抑制腫瘤細胞增殖、腫瘤血管生成并提高機體自身免疫力來體現[11]；黃芪抗腫瘤作用機制是多方面的，包括增強機體免疫功能、直接抑瘤作用、促進腫瘤細胞凋亡、抗腫瘤血管生成、影響機體的氨基酸代謝等，該藥所含有的多糖類成分是發揮作用的主要活性物質[12]；薏苡仁味甘、淡、性涼，現代藥理研究發現其通過降低血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF）的表達來抗腫瘤血管生成從而達到抑制腫瘤功效[13]。因而，直接細胞毒作用、抑制腫瘤血管生成及調節機體免疫功能等作用途徑的綜合效應很可能是抗癌防移片抑制腫瘤生長與轉移的機制所在，而該復方制劑的綜合效應是否是各組分作用的簡單相加，其中哪些作用機制占主導地位，仍有待后續實驗研究進一步探討。

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（本文編輯 徐愛良）

Experimental Study of Kang'ai Fangyi Tablet's Curative Effect Against 4T1 Mice Breast Cancer

HOU Chao1,HU Zhiχi1,ZENG Borong2,LI Lin1,CHEN Longjiao3
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan,410208,China;
2.The First Affiliated Hospital of HUCM,Changsha,Hunan,410007,China;
3.Guangzhou university of Chinese medicine,Guangzhou,Guangdong,510000,China)

Objective To observe the effect of Kang'ai Fangyi Tabelt on 4T1 breast cancer of mice.Methods The mouse model of 4T1 breast cancer was established.The experimental mice were divided into four groups randomly which were called control group,model group,cytoxan group and Kang'ai Fangyi Tablet group;and then,gave a regular injection of cytoxan,Kang'ai Fangyi Tabelt or saline to the mice,respectively,except control group.The living condition of mice during administration was observed in a dynamic way.After four weeks,the mice was killed and the percentage of physique gain,the volume of tumor,the inhibition rate of tumor volume and the number of lung metastases were calculated.Results 1)Compared with the model group,the tumor of Kang'ai Fangyi Tabelt group mice grew slowly with less pulmonary metastasis tumor(P<0.05);2)Compared with cytoxan group,the negative effect of Kang'ai Fangyi Tabelt group is less significantly(P<0.05),having better quality of life,but the function of Cytoxan's tumor inhibition and prevention of tumor metastasis was stronger.Conclusion Kang'ai Fangyi Tabletcan inhibitthe growth and metastasisof4T1 breastcancer,improving the quality of mouse life.

Kang'ai Fangyi Tabelt;4T1 mice breast cancer;tumor volume;the inhibition rate of tumor volume;the number of lung metastasis

R285.5；R737.9

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.04.003.006.04

2013-11-26

國家自然科學基金資助項目(81373550)；湖南省高校創新平臺開放基金重點項目(11K049)。

侯 超，男，在讀碩士研究生，研究方向：從事中醫腫瘤證治規律研究。

*胡志希，教授，博士研究生導師，E-mail：515800272@qq.com。