電針小海與下巨虛穴對十二指腸潰瘍大鼠血清腫瘤壞死因子-α及十二指腸核因子-κB的影響

鄧石峰，張 泓*，張雨辰，楊璐佳，王珍珍

（1.湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410007）

電針小海與下巨虛穴對十二指腸潰瘍大鼠血清腫瘤壞死因子-α及十二指腸核因子-κB的影響

鄧石峰1，張 泓1*，張雨辰2，楊璐佳1，王珍珍1

（1.湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410007）

目的 觀察電針十二指腸潰瘍（Duodenal ulcer，DU）大鼠“小海”、“下巨虛”后對血清腫瘤壞死因子-α（Tumour Necrosis Factor-α，TNF-α）含量及十二指腸組織核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）表達的影響。方法將40只健康SD大鼠隨機分為空白、模型、小海、下巨虛四組，每組雌雄各半，除空白組外均皮下注射鹽酸半胱胺建立DU模型大鼠。造模成功并治療10 d后，肉眼和光鏡下分別觀察大鼠十二指腸黏膜潰瘍情況及組織形態學變化，ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α含量，免疫組織化學法檢測十二指腸NF-κB的表達。結果 與空白組比較，各組大鼠光鏡下十二指腸組織病理損傷改變明顯，DU肉眼評分、血清TNF-α含量及十二指腸組織NF-κB表達顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，小海、下巨虛組組織損傷有所改善，且DU肉眼評分、血清TNF-α含量及NF-κB表達顯著降低（P＜0.01）；與小海組比較，下巨虛組組織損傷恢復較好，且肉眼評分、血清TNF-α含量及NF-κB表達降低（P＜0.01或P＜0.05）。結論 電針小海、下巨虛穴均能對DU起治療作用，且下巨虛組效果優于小海組，部分證實“合治內府”之“合”主要應指下合穴。其治療效應可能是通過抑制核因子的活性、降低血清TNF-α等促炎因子的含量來實現的。

十二指腸潰瘍；合治內府；電針；腫瘤壞死因子-α；十二指腸核因子-κB；小海；下巨虛；大鼠

對于特定穴中“合穴”的臨床應用，《靈樞·邪氣臟腑病形》提出了：“滎輸治外經，合治內府”、“治內府奈何？取之于合”的原則。大量研究表明[1-3]，針刺合穴對相應臟腑疾病有良好的治療效果。從具體的選穴來看則是以下合穴為主，很少選用經合穴，如治療小腸病多以下巨虛為主，極少涉及小海穴[4-5]。那么就小腸腑而言，“合治內府”中的“合”到底是指經合穴還是下合穴，還是兩者皆是？針對上述問題，我們選取較為經典的小腸腑病——十二指腸潰瘍（Duodenal ulcer，DU）為研究對象，以手太陽小腸經經合穴小海、下合穴下巨虛為刺激點，觀察電針后DU大鼠十二指腸潰瘍評分、血清腫瘤壞死因子-α（Tumour Necrosis Factor-α，TNF-α）含量及十二指腸組織核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的表達，以初步探討其對DU可能的治療機制以及 “合治內府”的部分內涵，同時也為特定穴臨床應用的相對特異性研究進行一些有益的嘗試。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

健康SD大鼠40只，SPF級，雌雄各半，體質量205～235 g，飼養溫度20～25℃，濕度50%～70%（動物及飼料由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證編號：4304701041）。大鼠適應性飼養1 w。于實驗前24 h禁食不禁水，隨機分為4組：空白組、模型組、小海組和下巨虛組，每組10只，雌雄各半。

1.2 主要材料、試劑與儀器

主要材料和試劑：鹽酸半胱胺（美國sigma公司進口），毫針 （規格0.3 mm×25 mm，蘇州醫療用品廠），即用型SABC免疫組化染色試劑盒、棕黃色DAB顯色劑 （武漢博士德公司），NF-κB多克隆抗體（中杉金橋），TNF-α酶聯免疫分析試劑盒（上海國藥生物）。

主要儀器：SDZ-V型電子針療儀 （蘇州醫療用品廠有限公司），CBV-1500A型無菌工作臺（上海瑞仰凈化裝備有限公司），TGL16M 臺式高速冷凍離心機 (長沙科威實業有限公司)，MoticTeK3.1圖像采集系統（廈門產），OLYMPUSBx-70顯微鏡成像系統（日本OLYMPUS公司）。

1.3 造模方法

空白組注射生理鹽水作為對照，其余各組采用Szabo法[6]注射鹽酸半胱胺溶液制造DU大鼠。在大鼠禁食不禁水24 h后，皮下注射10%鹽酸半胱胺生理鹽水溶液300 mg/kg大鼠體質量，所有大鼠注射部位約當大鼠右臀部。造模24 h后，為了保持潰瘍的慢性過程，繼續給造模大鼠飲用1%鹽酸半胱胺生理鹽水溶液。并觀察大鼠的精神活動、飲食飲水等情況。

1.4 治療方法

穴位定取：根據林文注[7]主編《實驗針灸學》及華興邦制定的《實驗動物圖譜》提供的方法，并參照人體腧穴骨度分寸法量取：（1）小海位于大鼠前肢，前肘突與肱骨髁之間的凹陷中，直刺5 mm；（2）下巨虛位于大鼠后肢，約當下肢膝關節后外側，脛骨外上髁下約15 mm處，直刺5 mm。處理方法：在造模成功后第2天（造模后24 h）起，分別給予各組大鼠不同的處理：空白組大鼠不做任何處理；模型組大鼠只捆綁不針刺，每次30 min；小海組與下巨虛組大鼠捆綁后分別針刺雙側的小海穴、下巨虛穴，使用電針治療儀[（疏密波（10/50 Hz），左側接正極，右側接負極，以肢體出現震顫為度]，留針30 min。均每天1次，治療10 d。

1.5 觀察指標及檢測方法

治療結束后將各組大鼠麻醉，立即開腹，EP管行腹主動脈采血，之后置于臺式高速冷凍離心機4℃、4 000 r/min，離心15 min，取上清液于-70℃低溫冰箱保存，用于TNF-α的檢測，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定（ELISA）法，嚴格按照試劑盒所述步驟操作。

采血后迅速分離十二指腸，沿十二指腸系膜縱軸方向剪開并用冰生理鹽水沖洗干凈，先于10倍放大鏡下行肉眼潰瘍評分，取出一塊約150 mg左右的腸組織，10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，用于HE染色和NF-κB的免疫組化檢測。

肉眼下十二指腸組織黏膜潰瘍指數評分：按照Moraes[8]等的方法，并采用其改良后的評分標準[9]評價十二指腸黏膜損傷程度：0分為黏膜正常；1分為黏膜充血、水腫；2分為黏膜糜爛、出血；3分為淺潰瘍；4分為深潰瘍；5分為潰瘍穿孔。

1.6 統計學分析

2 結果

模型組大鼠造模后死亡1只 （死于十二指腸穿孔），小海組、下巨虛組治療過程中分別死亡2只和1只（死于十二指腸穿孔及急性感染），故納入統計大鼠共36只。

2.1 各組大鼠十二指腸潰瘍肉眼評分比較

空白組大鼠十二指腸黏膜正常；模型組大鼠十二指腸組織黏膜糜爛、出血嚴重；小海組及下巨虛組黏膜糜爛、出血較輕。結果見圖1。

圖1 各組十二指腸潰瘍組織圖

與空白組比，各組DU評分均升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；電針治療后，小海組和下巨虛組評分較模型組降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；且下巨虛組評分低于小海組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），結果見表1。

2.2 各組大鼠光鏡下十二指腸黏膜組織形態學改變

光鏡下，空白組十二指腸黏膜表面細胞完整，無潰瘍性損害，各層組織結構正常，未見萎縮、缺損；模型組大鼠十二指腸黏膜損傷明顯，可見明顯壞死和廣泛的破損、脫落，并見大量炎性細胞浸潤；小海組大鼠十二指腸黏膜表面有部分脫落，破損情況較模型組改善，炎性細胞少量集結；下巨虛組大鼠十二指腸黏膜表面有少量破損、脫落。綜上所述，小海組、下巨虛組較模型組明顯改善，且下巨虛組改善優于小海組，結果見圖2。

表1 各組大鼠十二指腸潰瘍肉眼評分的比較 （分）

圖2 各組光鏡下十二指腸組織形態學特征（HE×100）

2.3 各組大鼠血清中TNF-ɑ含量和十二指腸組織NF-κB表達比較

與空白組比，各組血清TNF-α含量及十二指腸組織NF-κB表達均升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；電針治療后，小海組和下巨虛組TNF-α含量及十二指腸組織NF-κB表達均較模型組降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；且下巨虛組TNF-α含量低于小海組，差異有顯著統計學意義 （P＜0.01），結果見表2、圖3。

3 討論

十二指腸潰瘍是消化系統的常見病、多發病。腸黏膜的糜爛、潰瘍是其最基本的病理變化，其并發癥包括出血、穿孔、癌變等[10]。形態學檢查是判定消化性潰瘍（Peptic ulcer，PU）的治療是否有效的一個非常重要且直觀可靠的方法[8，9，11]。 本實驗中，采用改良的Moraes方法對DU行肉眼評分，并結合光鏡下觀察進行評定，能夠較好地評價電針的治療效果。炎癥反應在DU發病中具有重要的意義，研究表明，在眾多炎性因子中TNF-α水平測定可作為判斷PU病變程度及療效的參考指標[12-13]。本實驗中，從大鼠形態學指標及血清TNF-α含量觀察分析可知：（1）大鼠DU模型復制成功；（2）電針小腸腑經合穴“小海”與下合穴“下巨虛”可能通過改善十二指腸黏膜的形態結構，降低血清炎癥因子的含量，最終對DU產生治療效應；（3）通過比較可知，“下巨虛”穴的效益要優于“小海”穴，具有相對特異性，就小腸腑而言，“合治內府”之“合”穴，主要應指下合穴。

表2 各組大鼠血清中TNF-ɑ含量和十二指腸組織NF-κB表達比較 （±s）

表2 各組大鼠血清中TNF-ɑ含量和十二指腸組織NF-κB表達比較 （±s）

組別空白組模型組小海組下巨虛組n 10 9 8 9 TNF-α（ng/L）110.76±13.92 361.06±9.45** 317.87±19.69**ΔΔ275.36±14.97**ΔΔ●●NF-κB（光密度值）0.10±0.02 0.30±0.03** 0.19±0.04**ΔΔ0.16±0.04**ΔΔ●

圖3 各組光鏡下十二指腸粘膜核因子-κB表達（×100）

近年來研究發現NF-κB在炎癥性腸病的發生發展中起著重要的作用[14-16]。本實驗中，模型組十二指腸組織中NF-κB大量表達，這與戴幸平等[17-18]在PU及潰瘍性結腸炎中觀察到的一致，這可能意味著在DU發病中，NF-κB受到炎性因子的刺激而活化，并進一步加劇炎癥反應，使得血清中TNF-α等炎癥因子的含量增高；而電針小海、下巨虛可能通過影響NF-κB進而降低TNF-α等炎性因子的產生，其具體機制有待進一步研究；小海組與下巨虛組之間的差異體現了不同穴位之間的差異性。

綜上所述，電針小海穴及下巨虛穴均對DU有治療作用，且下巨虛穴優于小海穴，就小腸腑而言，“合治內府”之“合”主要應指下合穴，其確切內涵仍需進一步研究；可能的部分治療機制是通過抑制核因子的表達、降低炎癥因子（TNF-a等）的合成與釋放來實現。

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（本文編輯 匡靜之）

Effects of Electroacupuncture on Serum TNF-α Level and Duodenal Tissue NF-κB Expression in DU Rats

DENG Shifeng1,ZHANG Hong1*,ZHANG Yuchen2,YANG Lujia1,WANG Zhenzhen1
(1.College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;
2.The Second Affiliated Hospital of HUCM,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective By electroacupuncture at Xiaohai and Xiajuxu points on duodenal ulcer model rats,to observe the effect of electroacupuncture on serum TNF-α level and duodenaltissue NF-κB expression,and to analyze their mechanism to which they related,briefly explaining the meaning of He points in curing viscera diseases by He points.Methods Forty SD rats were randomly divided into 4 groups:Blank group,Model group,Xiaohai group and Xiajuxu group.Set up the Duodenal Ulcer rat models through injection of cysteamine hydrochloride at the right buttock.After molding,following electro-acupuncture at rat's XiaoHai and XiaJuXu acupoint,EA parameters density wave (10/50 Hz),a negative electrode on the right and the positive one left, the intensity between 1～3 mA,with limb tremor in degrees needle for 30 minutes once a day for 10 days.After treatment,make DU score by eyes first.Histological changes in the duodenum were observed by light microscopy.ELISA is used to check models'serum TNF-α level and the expression of NF-κB in the duodenum were detected by immunohistochemistry.Results The DU score,serum TNF-α levels and NF-κB expression of Model,Xiaohai and Xiajuxu groups are significantly higher than the Blank group(P<0.01)and the tissue injurychanges are obviously under lightmicroscope.Compared with Modelgroup,the tissue injury changesofXiaohaiand Xiajuxu groups improved obviously,the DU score,serum TNF-α levels and NF-κB levels of Xiaohai and Xiajuxu groups are significantly lower(P<0.01).Compared with Xiaohai group,the tissue injury changes of Xiajuxu group improved well,the DU score,serum TNF-α and NF-κB levels is obviously lower (P<0.01 or P<0.05).Conclusion Electroacupuncture at Xiaohai and Xiajuxu point have treatment effects on DU rats,and the effects of Xiajuxu is obvious better than Xiaohai,which proves Xiajuxu has relative specificity.This result partly confirmed:"He""He Zhi Nei Fu"should refer to the Xia He point.The treatment mechanism of He point might inhibit the activity of NF-κB and reduce the serum TNF-α level.

duodenalulcer;curing viscera diseasesby He points;TNF-α;NF-κB; electro-acupuncture

R245.3；R573.1

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.04.011.036.05

2014-02-18

國家自然科技基金項目（81173327/H2718）。

鄧石峰，男，在讀碩士研究生，研究方向：針灸對常見病康復機理的研究。

*張 泓，男，教授，博士，博士研究生導師，E-mail：zh5381271@sina.com。