冠心病心絞痛寒凝血瘀證動物模型的建立*

王 朋，楊明會，李紹旦，霍 旺，劉 毅，張俊修

(1.北京中醫藥大學第一臨床醫學院，北京 100700;2.解放軍總醫院中醫研究所，北京 100853)

冠心病心絞痛是臨床常見病、多發病，嚴重威脅人群健康。據臨床流行病學調查研究顯示，寒凝血瘀證是本病的常見多發證型，給患者帶來極大的痛苦[1]，因此開展冠心病心絞痛寒凝血瘀證的基礎研究，具有臨床現實意義。本研究擬采用垂體后葉素單一因素大劑量靜脈注射的方法，建立冠心病心絞痛寒凝血瘀證病證結合模型，并對該模型從宏觀體征、心電圖、心肌微循環等方面進行觀測，以綜合評價該模型的證候屬性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

垂體后葉素注射液pit(6 U/ml，南京新百藥業有限公司，批號111204)，烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司，批號T20111110)，TXB2放射免疫試劑盒(北京普爾偉業生物科技有限公司，批號20121025)，6-Keto-PGF1α放射免疫試劑盒(北京普爾偉業生物科技有限公司，批號20121025)。

MP-100多導生理記錄儀(美國BIOPAC公司)，MC-142L歐姆龍電子體溫計(歐姆龍大連有限公司)，ALC-V8動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)，BX51WI正立微循環顯微鏡(Olympus公司)，SN-697B自動γ放射免疫計數器(上海原子核研究所日環儀器廠)，1-15k離心機(德國Sigma公司)。

1.2 動物與分組

健康雄性SD大鼠40只，體質量220±20 g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供(動物合格證號SCXK-(軍)2007-004)。將大鼠按隨機數字表法分為2組，即正常組和模型組，每組20只。

1.3 造模方法

大鼠用20%烏拉坦5 ml/kg腹腔注射進行麻醉，仰臥位固定于鼠臺上，連接生理記錄儀，記錄大鼠標準Ⅱ導聯心電圖。大鼠經口氣管插管，連接小動物呼吸機。解剖并分離出股靜脈進行靜脈置管。準備完畢后，模型組注入垂體后葉素 6 U/kg[2](濃度為2 U/ml)，5 s恒速注射完畢，正常組注射等量生理鹽水，在造模后30 min按照下述方法觀測各項指標。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 體溫 將電子體溫計插入大鼠肛門約2 cm處，直到電子體溫計數值穩定，讀取屏幕數據。

1.4.2 心電圖指標 記錄造模后30 min內標準Ⅱ導聯心電圖，以QRS波群的終點與ST段交接處的J點位移判斷心肌缺血發生與否，并以PR段為基線記錄J點位移，以J點上升或下降≥0.1 mV視為發生心肌缺血心絞痛[3]，同時記錄大鼠心率變化。

1.4.3 微靜脈管徑及紅細胞流速 大鼠取平臥位開胸暴露心臟，置于正立顯微鏡載物臺上，在外落射光源照明下，觀察心肌微循環變化。打開連接在顯微鏡上的高速攝像機以500 F/s的速度記錄心肌表面的微循環動態圖像，再以25F/s的速度重放高速記錄的圖像。將視頻資料轉化為圖像文件，采用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件測定微靜脈管徑和紅細胞流速，以造模前的數值作為基準值，結果用各時間點的數值與基準值比值來表示[4]。

1.4.4 血漿 TXB2、6-Keto-PGF1α腹主動脈采血3ml注入EP管，預先加入消炎痛-EDTA.Na2液0.2 ml，顛倒混勻，4℃3500 rpm離心15 min，分離血漿，放射免疫法測定TXA2、PGI2的穩定代謝產物TXB2、6-Keto-PGF1α，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件行統計分析，定量數據以均數±標準差(s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體征

正常組大鼠唇周、爪子、耳殼、尾巴顏色淡紅，溫度正常，大便成形;模型組大鼠唇周、爪子顏色紫暗，爪溫下降，耳殼、尾巴變白發涼，大便濕爛，其中有2只大鼠造模后有大量粉紅色泡沫樣液體從鼻腔內流出，繼而死亡。

2.2 體溫

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠體溫在造模前差異無統計學意義(P＞0.05)，造模后體溫降低差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 心電圖

表2顯示，與正常組比較，模型組大鼠J點在造模前差異無統計學意義(P＞0.05)，在造模后J點位移顯著增加(P＜0.05)。模型組大鼠造模后心率減慢，與正常組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 大鼠造模前后體溫測定比較(s)

表1 大鼠造模前后體溫測定比較(s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05

組 別 例數 造模前(℃)造模后(℃)10 36.78±0.53 36.72±0.81模型組 10 36.89±0.66 35.88±0.74正常組*

表2 大鼠造模前后心電圖變化比較(s)

表2 大鼠造模前后心電圖變化比較(s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組心率(次/分)別 例數 J點位移(mv)造模前 造模后 造模前 造模后正常組10 0.033±0.013 0.031±0.015 438±52 440±56模型組 10 0.036±0.017 0.178±0.029*441±55 352±40＊＊

2.4 大鼠造模前后微靜脈管徑和紅細胞流速變化比較

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠心肌微靜脈收縮，管徑明顯減小，紅細胞流速減慢，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表3 大鼠造模前后微靜脈管徑和紅細胞流速變化比較(s)

表3 大鼠造模前后微靜脈管徑和紅細胞流速變化比較(s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05

組例數 管徑 流速正常組別10 1.00 1.00模型組 10 0.90±0.07* 0.89±0.05*

2.5 大鼠造模后血漿TXB2、6-Keto-PGF1α變化比較

表4顯示，與正常組比較模型組血漿TXB2水平顯著升高，6-Keto-PGF1α水平降低，TXB2/6-Keto-PGF1α值顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05或P ＜0.01)。

表4 大鼠造模后血漿TXB2、6-Keto-PGF1α變化比較(s)

表4 大鼠造模后血漿TXB2、6-Keto-PGF1α變化比較(s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別例數TXB2(pmol/L)6-Keto-PGF1α(pmol/L)TXB2/6-Keto-PGF1α 10 117.9±24.14 414.80±61.00 0.29±0.06模型組 8 236.9±41.32＊＊ 312.54±55.37* 0.75±0.13正常組＊＊

3 討論

證候的研究是中醫理論和臨床研究的核心與關鍵問題。由于證候多依附于某種疾病，二者緊密聯系，因此在辨證論治的同時也需要進行辨病，即辨病辨證相結合。證候動物模型是研究中醫證候本質與規律的重要工具，其中的病證結合模型便是辨病與辨證相結合方法在證候動物模型上的具體體現。由于其同時具有西醫疾病的特點和中醫證候的特征，符合臨床實際，因此在中醫藥基礎研究中得到廣泛的認可和推廣[5]。

目前病證結合模型多是根據西醫理論塑造疾病模型，根據中醫理論施加人為干預因素塑造證候模型，再把二者結合起來，利用這種疊加方法建立的模型病與證干預因素相互影響，其模型的穩定性和可靠性無法保證[6]。因此，有學者[7]提出了新的研究思路，即在西醫疾病模型的基礎上，不施加人為干預因素，觀察并檢測模型動物的宏觀表征和微觀指標，綜合上述結果進行證候屬性判定。這種按照臨床診療思路構建的模型客觀性強、可信度高，更貼近于臨床實際。本研究正是基于這種思路，采用單一藥物因素作為病證結合模型疾病與證候共同的造模因素，探索建立冠心病心絞痛寒凝血瘀證病證結合動物模型，并對其進行證候評價。

3.1 冠心病心絞痛動物模型建立

垂體后葉素(pituitrin，pit)是從動物腦垂體中提取的物質。研究證實，過量的pit靜脈注射可引起冠狀動脈較長時間強烈痙攣，同時使全身小血管收縮，外周負荷加重，心肌耗氧量增加，從而引起急性心肌缺血，導致急性心絞痛的發作[8]。本研究采用垂體后葉素6U/kg大劑量股靜脈注射的方法建立動物模型，通過觀察其心電圖變化發現，在造模后30 min ST段顯著抬高且大于0.1mV，符合急性心肌缺血心電圖的典型變化，說明冠脈痙攣性心絞痛動物模型建立成功[9]。

3.2 寒凝血瘀證動物模型的評價

中醫“證”的動物模型，應符合中醫病因學說和辨證診斷規律。研究表明[10，11]，垂體后葉素大劑量造模具有明顯的寒邪致病特點。本實驗采用垂體后葉素靜脈注射造模，不僅在病因上符合中醫理論，而且符合臨床急性心絞痛寒邪直入心脈的發病特點。

癥狀和體征是辨識證候的主要依據。臨床上冠心病心絞痛寒凝血瘀證發病時常表現為手足不溫、厥冷，胸痛如絞，口唇、爪甲青紫，舌紫暗。本研究首先通過觀察比較大鼠造模前后一般狀況的變化，來獲取大鼠的宏觀體征和診斷信息，再運用中醫理論進行綜合辨證分析，確定模型的證候屬性。實驗中我們觀察到，模型組大鼠唇周、爪子顏色紫暗，爪溫下降，耳殼、尾巴變白發涼，大便濕爛，心率減慢，這些均符合中醫寒凝血瘀證候表現。

微觀理化指標是辨識證候的輔助和有效補充。本研究借助現代技術檢測手段，從器官、細胞、分子水平獲取信息，在較深層次上對模型進行微觀辨證。心電圖變化是反映心肌缺血與否的直觀指標，微靜脈管徑和紅細胞流速是反映心肌微循環情況的有效指標。TXB2、6-keto-PGF1α是 TXA2與 PGI2的穩定代謝產物。TXA2與PGI2是一組由血管內皮細胞合成并釋放的血管活性物質，TXA2能促進血管收縮和血小板聚集，PGI2能舒張血管，抑制血小板聚集，二者相互拮抗，在生理狀態下血漿中二者的濃度比值相對平衡，從而維持適當的冠脈張力和血小板內環境穩定[12]。

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠體溫下降，心率減慢，心電圖表現為心肌缺血;心肌微靜脈收縮，紅細胞流速明顯減慢，TXB2/6-Keto-PGF1α值顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。綜合分析微觀理化指標后我們認為，這些變化符合寒凝血瘀證的微觀表現。寒為陰邪，直入心脈，損傷心陽，心陽無力鼓動血液運行，故見體溫下降、心率減慢、心肌缺血等“寒邪傷陽”表現;“寒性收引、凝滯”，寒邪內侵，引起心脈絀急、氣血凝滯，故在微觀視野中相應地表現為心肌微血管收縮、紅細胞流速減慢等微循環障礙等血瘀表現;TXA2/PGI2的失衡被認為是血瘀證的特征之一[13]，寒邪入脈，血管收縮，損傷血管內皮，致使PGI2等抗凝抗栓物質的生成釋放減少，而TXB2等促凝促栓物質生成釋放增加，二者失衡可導致血管痙攣加重、血小板聚集、血栓形成等病理改變，使得血行障礙而為寒凝血瘀證。

綜上所述，通過對模型宏觀表征和微觀指標的辨證分析，我們認為大鼠冠心病心絞痛寒凝血瘀證模型成功建立。該模型既符合現代醫學疾病病理變化特點，也符合中醫證候特征，可靠性及穩定性較好。本實驗借助現代醫學的先進技術，對寒凝血瘀證模型進行深層次微觀辨證的同時，在一定程度上也是對證候的物質基礎和變化實質的深入闡釋。該模型的成功建立對于中藥藥效的評價和中藥作用機理的研究頗有意義，能更好地為臨床診療服務。

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