辛伐他汀對兔股動脈球囊損傷后內膜增生和平滑肌細胞增殖的影響

梁剛柱，張福先，劉勇

·實驗研究Experimental research·

辛伐他汀對兔股動脈球囊損傷后內膜增生和平滑肌細胞增殖的影響

梁剛柱，張福先，劉勇

目的評價辛伐他汀對兔股動脈球囊損傷后血管狹窄和平滑肌細胞增殖的影響。方法將24只雄性新西蘭兔隨機分為假手術組、動脈狹窄模型組和辛伐他汀組，每組8只。除假手術組外，其余兩組行股動脈球囊損傷，辛伐他汀組給予辛伐他汀灌胃干預。術后第14天處死實驗兔，取出血管標本，處理后行HE染色觀察組織病理變化。計算機病理圖像分析系統測量動脈管腔、內彈力層、外彈力層圍繞面積，計算內膜、中膜面積和內膜/中膜面積比值，免疫組化法檢測動脈壁增殖細胞核抗原（PCNA）表達，觀察平滑肌細胞增殖情況。結果與動脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組血管管腔面積增加，但差異無統計學意義（P=0.057），新生內膜面積顯著減少（P=0.006），內膜/中膜面積比值降低，但差異無統計學意義（P=0.16），血管壁PCNA的陽性表達指數顯著降低（P=0.003）。結論辛伐他汀可以顯著抑制兔股動脈球囊損傷后內膜增生和平滑肌細胞增殖。

股動脈；球囊損傷；辛伐他汀；動物實驗

目前，經皮腔內血管成形術（percutaneous transluminal angioplasty，PTA）是治療外周動脈硬化閉塞癥（peripheral arterial occlusive disease，PAOD）的有效方法。但是術后管腔再狹窄影響了其遠期療效，有報道顯示下肢動脈PTA術后1年再狹窄率達40%～60%［1-2］。PTA后血管內皮細胞損傷和脫落，誘發血管平滑肌細胞（VSMC）大量增殖并向內膜遷移引起內膜增生以及血管重構，是PTA術后再狹窄的主要病理機制［3］。既往研究表明他汀類藥物在動脈系統中有不依賴其降脂作用的促動脈內皮修復和預防動脈粥樣硬化、預防動脈血栓形成的作用［4-5］，但對他汀類藥物在預防外周動脈PTA術后再狹窄的作用研究較少［6］。我們通過建立兔股動脈球囊損傷模型，觀察辛伐他汀對該模型血管管腔狹窄程度、內膜增生程度以及VSMC增殖的影響，探討其在防止PTA術后血管再狹窄形成中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用體重2.5～3.5 kg的雄性新西蘭兔24只（購自北京維通利華實驗動物有限公司），分籠飼養。將24只兔隨機分為假手術組、動脈狹窄模型組和辛伐他汀組，每組8只。辛伐他汀組給予辛伐他汀粉劑與蒸餾水配成的溶液，以3 mg·kg-1·d-1灌胃，假手術組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。三組均喂養至2周末取材。

1.2 建立血管損傷動物模型

用5%戊巴比妥鈉（30mg/kg）耳緣靜脈麻醉后，解剖暴露兔右側股動脈遠端達腘動脈，在腘動脈遠端結扎，阻斷近端，之間作一長約0.5 cm的切口，向近端送入3 F Forgarty球囊導管達髂動脈，深入約10 cm，向球囊內注入生理鹽水，維持壓力，緩慢回拉球囊至平切口處，回抽球囊內液體維持負壓，再將導管送至原處，重復上述過程5次，使血管內皮充分剝脫。退出導管，縫合切口。術后每天肌注青霉素80萬u，連續3 d。假手術組不插入球囊，余步驟同上。

1.3 檢測方法

于術后第14天處死動物，小心取出模型段血管（球囊損傷的股動脈全程），迅速置于4%多聚甲醛中固定，然后取材，逐級脫水、石蠟包埋。

1.3.1 血管管腔病理形態學檢測將石蠟包埋標本5μm厚切片用蘇木精-伊紅（HE）染色后攝像，用MiE V2.0圖像分析系統分別測量管腔面積、內彈力層圍繞面積和外彈力層圍繞面積，以毫米2（mm2）表示。通過以上測定結果，計算新生內膜面積、中膜面積以及新生內膜/中膜面積比值，每次測量3次，取平均值。具體計算方法如下：新生內膜面積=內彈力層圍繞面積-管腔面積；中膜面積=外彈力層圍繞面積-內彈力層圍繞面積；新生內膜/中膜面積比值=新生內膜面積/中膜面積。

1.3.2 免疫組化檢測增殖細胞核抗原（PCNA）表達將石蠟包埋標本于不同切面切3張5μm厚切片，置于載玻片（均經APES防脫片處理）上，抗PCNA抗體為I抗，陽性對照用人乳腺癌切片，陰性對照用PBS緩沖液代替I抗，進行免疫組化染色。PCNA表達評定方法：PCNA陽性細胞的胞核染成棕黃色，高倍鏡（200倍）采集圖像，利用圖文分析系統隨機測量每張切片中3個視野，計數內膜細胞中陽性細胞數，計算PCNA陽性細胞百分率，取其均值。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 三組血管管腔形態、面積比較

光鏡下，假手術組右側股動脈內彈力層內側為一層藍染的內皮細胞覆蓋，內彈力層完整，呈卷曲“城墻狀”，動脈壁各層結構完整，中膜VSMC呈梭型，排列整齊，分布均勻，外彈力層完整。動脈狹窄模型組內膜增生嚴重，向腔內呈丘狀隆起，可見大量VSMC排列紊亂，內彈力層輕度拉伸，形態不規則。與動脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組內膜增生程度較輕，管腔較光滑，內膜中VSMC均較少，見圖1。

與動脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組血管管腔面積增加，但差異無統計學意義（P=0.057，表1）。

與動脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組血管管腔面積、內彈力層圍繞面積和外彈力層圍繞面積無明顯增加（表1）。

與動脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組新生內膜面積減少，差異有統計學意義（P=0.006），內膜/中膜面積比值減小，但差異無統計學意義（P= 0.16），見表1。

2.2 免疫組化染色形態學觀察PCNA表達

圖1 三組血管管腔形態（HE，×200）

表1 三組血管管腔面積、內/外彈力層圍繞面積、新生內膜面積、中膜面積、內膜/中膜面積比值比較（±s）

表1 三組血管管腔面積、內/外彈力層圍繞面積、新生內膜面積、中膜面積、內膜/中膜面積比值比較（±s）

與動脈狹窄模型組比較，aP＜0.05

組別管腔面積（mm2）內彈力層圍繞面積（mm2）外彈力層圍繞面積（mm2）新生內膜面積（mm2）中膜面積（mm2）內膜/中膜面積比值假手術組（n=8）1.06±0.16 1.06±0.16 1.69±0.14-0.63±0.1-動脈狹窄模型組（n=8）0.58±0.12 1.09±0.13 1.75±0.15 0.51±0.06 0.66±0.08 0.78±0.11辛伐他汀組（n=8）0.73±0.17 1.08±0.15 1.71±0.14 0.35±0.13a0.63±0.15 0.63±0.41

鏡下觀察，PCNA陽性細胞的胞核染成棕黃色。正常動脈管壁PCNA表達極少或無表達。各實驗組PCNA陽性細胞主要聚集在新生內膜，中膜表達極少或無表達。

2.2.1 PCNA陽性指數比較與假手術組相比，動脈狹窄模型組與辛伐他汀組新生內膜中VSMC細胞有不同程度的PCNA表達，辛伐他汀組PCNA陽性細胞指數（17.25±6.88）小于動脈狹窄模型組（33.78±7.87），差異有統計學意義（P=0.003），見圖2。

圖2 三組PCNA表達（免疫組化，×200）

3 討論

目前，抗血小板藥物是預防PTA術后再狹窄的主要手段，其機制在于抗血小板藥物可以抑制血小板活化引起的內膜增生，ACCP指南第9版推薦外周動脈PTA術后長期使用阿司匹林或氯吡格雷預防再狹窄［7］。雖然，抗血小板藥物可以降低再狹窄的發生，但是再狹窄依然是制約PTA治療效果的瓶頸。PTA術后再狹窄的機制復雜，涉及血管內皮細胞損傷、VSMC增殖和遷移及血管重構等多個方面。在血管損傷局部，活化的血小板、炎性細胞產生很多促細胞分裂劑和細胞因子，刺激中膜VSMC增殖、遷移及表型轉變，分泌細胞外基質，膠原沉積，導致內膜增生，發生管腔再狹窄［3］。

既往研究發現，他汀類藥物除降低血膽固醇外，還具有抗炎、改善內皮功能及舒張血管降壓、抑制血管平滑肌的遷移和增生、抑制血小板聚集及抗凝等作用［4-5，8-10］，提示其在預防PTA術后再狹窄中有潛在的應用前景。Kappert等［11］發現他汀類藥物可以增加大鼠頸動脈球囊損傷后血管腔面積，但是新生內膜面積、內膜/中膜面積比值與模型組相比差異無統計學意義。van der Harst等［12］在大鼠主動脈內植入支架，喂養瑞舒伐他汀的實驗組大鼠主動脈新生內膜面積較對照組減少23%［（0.66±0.06）mm2比（0.51±0.02）mm2，P＜0.05］，并證實其機制與瑞舒伐他汀保護內皮功能有關。Preusch等［13］從PTA術后血管重構角度研究他汀類藥物在抑制內膜增生中的作用，發現在球囊擴張損傷頸動脈大鼠模型中瑞舒伐他汀可以顯著抑制內膜增生，但該機制與瑞舒伐他汀對細胞基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達的影響無關。翟國君等［14］發現，他汀類藥物可以減少犬靜脈人工血管橋內膜增生。Lin等［15］研究發現，辛伐他汀可以抑制兔腫瘤壞死因子-α誘導的白細胞介素-18的表達，抑制兔主動脈VSMC增殖。Janardhanan等［16］研究發現，辛伐他汀可以降低動靜脈瘺術后血管內皮生長因子-A（VEGF-A）和MMP-9的基因表達，抑制血管內膜增生和血管重構。趙鋼等［17］研究發現，載有他汀類藥物的納米粒子涂層支架可抑制支架內再狹窄。以上研究提示他汀類藥物確實可以抑制PTA術后的內膜增生，其機制涉及內皮功能的保護、抑制血管重構、抑制VSMC增殖等內膜增生的多個環節。本研究發現球囊損傷血管后，動脈狹窄模型組內膜增生明顯，給予辛伐他汀干預后，新生內膜面積明顯減少，提示辛伐他汀可有效抑制球囊損傷后VSMC增殖和內膜增生。本研究從VSMC增殖角度研究其相關機制，選用PCNA的表達觀察VSMC增殖情況。PCNA的高表達提示細胞內DNA合成反應旺盛，是S期細胞的良好標志物，是評價細胞增生的良好指標。本研究發現動脈狹窄模型組新生內膜VSMC中PCNA呈高表達，而辛伐他汀組中PCNA陽性指數減少，提示他汀類藥物可以通過抑制VSMC增殖抑制PTA術后的內膜增生。本實驗改進了目前常用的兔頸動脈球囊損傷模型，采用兔股動脈球囊損傷狹窄模型，在球囊損傷股動脈全程后，結扎腘動脈，其流出道由隱動脈代償，臨床上更接近于下肢動脈病變流出道少的特點。

本研究結果證實他汀類藥物可以抑制兔股動脈球囊損傷后的VSMC增殖和內膜增生，提示他汀類藥物對于下肢動脈PTA術后再狹窄的防治具有潛在的臨床應用前景，但其在預防外周動脈PTA術后再狹窄中的具體機制還需進一步深入研究。

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The effects of sim vastatin on in timal hyperp lasia and vascular smooth m uscle cell proliferation of balloon-injured fem oral ar tery in experimental rabbits

LIANG Gang-zhu，ZHANG Fu-xian，LIU Yong. Department of Vascular Surgery，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China

ZHANG Fu-xian，E-mail：zhangfuxian@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the effects of simvastatin on vascular stenosis and vascular smooth muscle cell（VSMC）proliferation of balloon-injured femoral artery in experimental rabbits.MethodsA total of 24 male New Zealand white rabbits were random ly and equally divided into three groups：the sham group（n=8），the artery stenosismodel group（n=8）and the simvastatin group（n=8）.Femoral artery stenosis was induced by injurieswith balloon in both themodel group and the simvastatin group，except for the sham group.The rabbits in simvastatin group were fed with simvastatin.The rabbitswere sacrificed on the 14th day after operation，and the femoral arteries were removed and sent for the pathological exam ination.The internal elastic lamina，external elastic lamina and luminal areasweremeasured.Then the areas of intima，media and the intima-to-media ratio were calculated.In order to observe the proliferation of VSMC，proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression of arterialwallwas tested and observed by immunohistochemistrymethod. Results In comparison with the model group，the average luminal area of the simvastatin group was increased although the differencewas not statistically significant（P=0.057）.The area of intima of simvastatin group was decreased（P=0.006），and the intima-to-media ratio was notably decreased，but the difference was of no statistic significance（P=0.16）.The PCNA expression of arterial wall was remarkably decreased（P=0.003）.ConclusionSimvastatin can effectively inhibit the intimal hyperplasia and the vascular smooth muscle cell proliferation of balloon-injured femoral artery in experimental rabbits.（J Intervent Radiol，2014，23：50-53）

femoral artery；balloon injury；simvastatin；animal experiment

R543.5

B

1008-794X（2014）-01-0050-04

2013-07-02）

（本文編輯：侯虹魯）

10.3969/j.issn.1008-794X.2014.01.014

100038北京首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院血管外科（梁剛柱、張福先），超聲科（劉勇）

張福先E-mail：zhangfuxian@yahoo.com