多藥耐藥基因在胃癌患者外周血的表達及其意義※

許 鳴 郭婉薇 李 博 張 智

多藥耐藥基因在胃癌患者外周血的表達及其意義※

許 鳴 郭婉薇 李 博 張 智

目的觀察胃癌患者外周血中多藥耐藥基因（MDR1）的表達水平，并探討其對提示腫瘤化學治療耐藥性的臨床意義。方法選擇42例胃癌初治患者，實施熒光定量逆轉錄PCR法檢測其外周血MDR1 mRNA表達情況，并以腫瘤組織中的MDR mRNA表達水平為參照，分析外周血MDR1 mRNA陽性率對腫瘤化學治療耐藥性的診斷效能。結果42例胃癌患者中，外周血MDR1基因陽性表達率為45.2%，腫瘤組織MDR1 mRNA陽性率為67.7%。胃癌患者的外周血MDR1 mRNA陽性者中，高齡、高分化、腫瘤直徑≥3cm者所占比例與腫瘤組織MDR1 mRNA陽性比較差異無統計學意義（P＞0.05）。外周血MDR1 mRNA診斷腫瘤耐藥的敏感度為67.9%，特異度100%。結論外周血中MDR1基因表達與腫瘤組織中的表達具有一致性，前者可作為后者的補充。

胃癌；腫瘤組織；多藥耐藥基因

目前，惡性腫瘤已成為日益常見且嚴重威脅我國居民生活質量的最主要疾病之一。胃癌具有早期易轉移、晚期難治、預后差等特點，病死率較高。胃癌的治療途徑主要有手術、放療和化療。化療在消化道腫瘤治療中占據重要地位，腫瘤細胞對化療藥物的多藥耐藥性（Multidrugresistance,MDR)是治療的主要障礙。有報道，MDR1基因的過度表達是腫瘤產生耐藥性的主要原因[1]。目前多采用術中切除的腫瘤組織作為檢測MDR1基因的標本，但可能延誤了患者的確診時間，而且無法為部分失去手術機會、依靠放化療治療的患者提供用藥依據。為此，本研究觀察胃癌患者外周血中多藥MDR基因的表達情況，并以腫瘤組織中的MDR1基因陽性率為參照，探討其對提示腫瘤耐藥性的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2010年1月～2011年12月我院收治初治胃癌患者42例為觀察組，均經術后病理活組織檢查確診。男28例，女14例；年齡32～71歲；高分化8例，低分化34例。另選擇同期在我院行胃切除術的非腫瘤患者10例為對照組，男7例，女3例，年齡36～67歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 應用實時熒光定量逆轉錄PCR法分別檢測外周血和腫瘤組織中 MDR1 mRNA的表達情況，多藥耐藥基因MDR1 mRNA核酸擴增熒光檢測試劑盒購自蘇州為真生物醫藥科技有限公司。主要儀器包括Lightcycler480定量PCR儀、低溫離心機、微量移液器及恒溫水浴箱。

1.2.2 標本采集、處理及保存 術前采集患者肘靜脈血 5ml，枸櫞酸鈉抗凝，淋巴細胞分離液分離有核細胞，將有核細胞收集到1.5ml試管中，15000rpm離心5min，棄上清液，在沉淀中加入Trizol（Invitrogen公司產品）500μl；取術中切除的新鮮腫瘤及對照組相應部位組織50mg，加入1ml Trizol RNA提取液用玻璃勻漿器勻漿；陽性對照取乙醇沉淀的RNA。分別混勻置室溫 10min，加入氯仿 100μl混勻，4℃10000rpm離心15min，吸取上層水相于1.5ml管中，并加入3倍體積預冷的異丙酸混勻，置冰上20min，15000rpm離心15min。棄上清液，用75%乙醇200μl漂洗，快速離心吸干液體，氣干后加入無菌 DEPC水20μl溶解RNA。取含逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNasin和dNTP MIX混和反應液8μl，加入預變性RNA 1μg（加水補足11μl），1μl隨機引物，將液體離心至管底。反應條件：65℃ 5min；25℃5min；42℃ 60min；70℃ 5min；4℃ 5min。反應完成之后即為cDNA。取含PCR反應液、Taq酶混和反應液18μl，加入10倍稀釋的逆轉錄反應產物2μl，預變性95℃ 5min、95℃ 10s、60℃ 15s、72℃ 20s，擴增40個循環；95℃ 1min、40℃ 1min、75℃ 1s、95℃ Continous。

1.2.3 結果判斷 按試劑盒說明書計算各檢測樣本的MDR1 mRNA相對表達量E，根據設定參考值判斷表達水平。

1.3 統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件包處理數據，各組MDR1 mRNA陽性率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血、組織MDR1 mRNA表達情況觀察組外周血MDR1 mRNA陽性19例（45.2%）、陰性23例（54.8%）；腫瘤組織MDR1 mRNA陽性28例（66.7%）、陰性14例（33.3%）。其中9例外周血MDR1 mRNA陰性者腫瘤組織MDR1陽性。對照組外周血、胃組織MDR1 mRNA均陰性。

2.2 胃癌患者外周血、腫瘤組織MDR1 mRNA與患者年齡、分化程度及腫瘤大小的關系胃癌患者的外周血MDR1 mRNA陽性者中，高齡、高分化、腫瘤直徑≥3cm者所占比例與腫瘤組織MDR1 mRNA陽性比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 胃癌患者外周血、腫瘤組織MDR1 mRNA與患者年齡、分化程度及腫瘤大小的關系[n(%)]

2.3 外周血MDR1 mRNA陽性對腫瘤耐藥性的診斷效能分析以腫瘤組織中的MDR基因表達水平為標準，外周血MDR1 mRNA診斷腫瘤耐藥的敏感度為 67.9%（19/28），特異度 100.0%（14/14)，陽性預測值 100.0%（19/19），陰性預測值 60.9%（14/23），診斷符合率78.6%（33/42）。

3 討論

在我國，胃癌是常見的消化道惡性腫瘤。由于部分患者的癥狀不明顯，就診時已是晚期而失去手術治療的機會，此時化學治療就顯得尤為重要。多藥耐藥基因MDR1的表達產物P-糖蛋白是一種ATP依賴型膜轉運蛋白，可以將藥物及許多其它相關分子從細胞內排出，并參與正常的生理活動[2]。MDR1基因在多種腫瘤細胞中均呈高表達，是導致腫瘤細胞對化學治療藥物產生耐藥性的重要因素之一[3-5]。因此，檢測MDR1基因的表達對胃癌患者化學治療方案的制訂有重要的指導意義。既往多使用術中切除的活組織作為檢測腫瘤耐藥性的標本，但可能延誤患者的確診時間，而且部分不能手術的患者也無法取得此標本，不利于早期診治[6]。相對于腫瘤組織標本，外周血標本較為容易獲取，尤其是不能手術者也可取得血液標本檢測腫瘤的耐藥性。本研究顯示，以腫瘤組織中MDR1 mRNA檢測結果為標準，外周血MDR1 mRNA診斷腫瘤耐藥的敏感度為67.9%，特異度100.0%，診斷符合率78.6%，且陽性預測值達100.0%，可作為早期篩選腫瘤耐藥性的方法之一。進一步研究顯示，外周血MDR1 mRNA陽性者其高齡、高分化、腫瘤直徑≥3cm者所占比例與腫瘤組織MDR1 mRNA陽性者一致。外周血標本取材簡便，患者依從性高，對于可手術的患者，檢測其外周血 MDR1 基因表達，可及早了解其腫瘤組織對化學治療的耐藥性，及早制訂術后的治療方案；對不可手術的患者，外周血 MDR1 基因檢測更是其化學治療方案擬訂與實施的重要依據。本研究的缺點是例數較少，結果尚需加大樣本量加以證實。

[1] 孫慶暖,郭成浩.mdr-1基因表達的熒光定量RT-PCR法檢測[J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(3):202-204.

[2] 李艷紅,王永華,李燕,等.MDR1基因多態性及其臨床相關性研究進展[J].遺傳學報,2006,33(2):93-104.

[3] 李治,黃韜,賀艷麗,等.乳腺癌干細胞逃逸化療機制的研究[J].中華實驗外科雜志,2007,24(1):20-21.

[4] Vinolas N,Provencio M,Reguart N,et al.Single nucleotide polymorphisms in MDR1 gen correlates with outcome in advanced non-small-cell lung cancer patients treated with cisplatin plus vinorelbine[J].Lung Cancer,2011,71(2):191-198.

[5] Zhang X,Li J,Qiu Z,et al.Co-suppression of MDR1 (multidrug resistance 1)and GCS (glucosylceramide synthase) restores sensitivity to multidrug resistance breast cancer cells by RNA interference[J].Cancer Biol Ther,2009,8(12):1117-1121.

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R735.2

A

1673-5846(2014)01-0156-02

廣東省第二人民醫院消化內科，廣東廣州 510317

2010年廣東省自然科學基金（科技計劃項目），編號：10151031701000009

張智，主任醫師。E-mail：zhang1965@126.com。