淺談凱氏定氮法測定食品中蛋白質的原理及注意事項

費麗娜

淺談凱氏定氮法測定食品中蛋白質的原理及注意事項

費麗娜

目的就凱氏定氮法測定食品中蛋白質的原理及注意事項進行分析。方法對凱氏定氮法測定食品中蛋白質的原理進行進一步的剖析，并對實驗過程中的四個關鍵環節中的關鍵點做歸納和總結。結果該方法有取樣、樣品消化、蒸餾、滴定4個步驟，使用的試劑也比較多。結論實驗者只有理解和掌握檢驗方法的原理和關鍵點，并在實驗中加以注意，方能保證結果的準確。

凱氏定氮法；測定食品中蛋白質；原理及注意事項

蛋白質（Protein）是生命的物質基礎，是生物重要的組成部分，各種酶、細胞因子都屬于蛋白質，因此蛋白質的重要性不言而喻[1]。蛋白質是以氨基酸為基本單位構成的生物高分子，蛋白質參與機體中的每一個細胞和所有重要組成部分，占人體重量的20%左右，因此，蛋白質是生命物質，也是食品中重要的營養指標。蛋白質測定最常用的方法是凱氏定氮法，它是通過測定氮含量從而換算成蛋白質的方法，是國際上通用的標準方法，其優點為實驗操作簡單、方便，測量結果的重復性和重現性好，而被廣泛應用于各類食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質含量測定中[2]。凱氏定氮法分為常量、半微量、微量法三種方法，其原理是食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨[3]。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。該方法有取樣、樣品消化、蒸餾、滴定四個步驟，其原理較為復雜，使用的試劑也比較多，以下將對這四個步驟進行簡單講述。

1 樣品的取樣

取樣應具有代表性，取樣前將樣品充分混勻，固體試樣可用粉碎設備制成細小均勻粉末。稱量放入凱氏定氮瓶時，切勿使樣品粘附在瓶頸部，避免樣品未消化完全而造成氮損失[4]。

2 樣品的消化

樣品中含氮有機化合物經硫酸在加熱的條件下消化，硫酸的作用促使有機物脫水炭化[2]。含氮的有機物炭化并生成碳，碳在將硫酸還原為二氧化硫的反應中，自身則被氧化成為二氧化碳；反應過程中產生的二氧化硫將氮還原為氨氣，此過程中其自身則被氧化成三氧化硫；而消化過程生成的氫，又加速了氨的形成。生成的水以水蒸氣的形式連同反應過程中生成的三氧化硫一同逸出，而氨氣則以硫酸銨的形式留在消化液中。

此過程的注意事項：①樣品消化時，對于含糖量很高或含脂量較多的樣品，應注意要緩慢升溫加熱，并隨時注意控制加熱的溫度，避免產生大量泡沫噴出或噴濺到瓶壁上，造成樣品的損失。若因加熱溫度不當，局部溫度過高使消化液噴濺到瓶壁上，應及時轉動凱氏定氮瓶將濺到瓶壁上的樣品消化液沖下，也可在樣品消化前加入少量辛醇或液體石蠟，以減少泡沫的產生。②消化時應不定時旋轉凱氏定氮瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，使樣品充分消化[5]。③若樣品難以消化至澄清透明的程度，可將凱氏定氮瓶從加熱器上取下，待其中溶液冷卻至室溫后，向消化液中加入少量過氧化氫，再繼續加熱直至完全消化。④整個消化過程中硫酸的量要充足，以保證樣品中含氮有機化合物的徹底消化。樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量，因消化時脂肪消耗硫酸的量較大，使硫酸缺少而影響測定。⑤在樣品消化末期，即消化液呈藍綠色并澄清透明后，再繼續加熱半小時即可，因此時瓶內消化液溫度過高，若長時間加熱，會使生成的硫酸氫銨分解并釋放出氨氣，使氮的含量損失，從而影響測定結果。

3 蒸餾

注意事項：①水蒸氣發生器中的水要呈酸性，因水中可能含有微量的氨離子，防止其受熱溢出而影響測定結果。②蒸餾反應過程中，硫酸銨為強酸弱堿鹽，可使消化液為弱酸性溶液。為保證測量結果的準確性，務必使結合態的氨能完全反應并釋放出來，因此整個蒸餾過程中，堿液的量不足，酸堿中和反應則不徹底，很難達到使氨充分分離的目的，從而使測量結果不準確。氫氧化鈉溶液既能中和樣品消化液中過量的酸，又可為氨的有效分離提供一個堿性環境，因此氫氧化鈉的用量要控制適當。實驗者可利用消化液中含有的銅離子，根據其特征顏色作為堿性反應的指示劑。當反應室內加入氫氧化鈉溶液后，其溶液顏色立即變為藍黑色時，表明氫氧化鈉已過量，能達到酸堿反應的要求，可保證反應完全進行。③加氫氧化鈉的漏斗要采用水封，避免因蒸餾裝置漏氣造成氨的溢出而影響測定結果。

4 滴定

氨以氣體的形式被釋放出來，用硼酸溶液吸收后，使用鹽酸或硫酸標準滴定液進行酸堿滴定，從而計算出樣品中蛋白質的含量。此過程的注意事項：①硼酸吸收液的溫度不宜過高，過高則氨的吸收能力將減弱，會影響測量結果，使結果偏低。最佳方式是保持溶液溫度在20℃以下，或將接收瓶置于冷水浴中。②硼酸吸收液的體積不使用精密量取，只要保證能將氨全部吸收即可，因為硼酸的酸性很弱，不會影響滴定。③滴定用的標準滴定液必須按照要求進行配制和標定，因其準確度直接影響測量結果的準確性。④計算蛋白質的含量時須乘以氮換算蛋白質的系數，一般食物為6.25。

5 小結

新鮮食品中的含氮化合物大都以蛋白質為主體，所以檢驗食品中的蛋白質含量時，只限于測定總氮量，然后乘以蛋白質換算系數6.25，即可得到蛋白質含量。凱氏定氮法可用于所有動、植物食品的蛋白質含量測定，因樣品中常含有核酸、生物堿等以及含氮色素等非蛋白質的含氮化合物，所以該法測定結果為粗蛋白質含量。筆者通過參加國家機構組織的“食品中蛋白質的測定”能力檢驗證，以反復實驗為基礎，在實驗過程中摸索可能影響實驗結果的關鍵點和注意事項，嚴格把握實驗原理，多次推敲與總結，得到上述實驗經驗，希望對以后的實驗者能有所幫助。

[1] 馬丹.凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量[J].計量與測試技術, 2008,35(06):57-58.

[2] 王燕.食品檢驗技術(理化部分)[M].1版.北京:中國輕工業出版社,2012:102-110.

[3] 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典[M].1版.北京:中國醫藥科技出版社,2010:53.

[4] 張朝武.現代衛生檢驗[M].1版.北京:人民衛生出版社,2005: 24-56.

[5] 中國藥品生物制品檢定所,中國藥品檢驗總所.藥品檢驗儀器標準操作規程[M].1版.北京:中國醫藥科技出版社,2010:181-183.

R155.5

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1673-5846(2014)01-0171-02

吉林市食品藥品檢驗所，吉林吉林 132001