小膠質細胞與白介素在帕金森病發病機制中作用的實驗研究※

陳 培孔祥盼楊曉帆

小膠質細胞與白介素在帕金森病發病機制中作用的實驗研究※

陳 培1孔祥盼2楊曉帆2

目的研究分析小膠質細胞和白介素在帕金森病（PD）中對發病機制的作用。方法采取立體定向術把嗜神經毒素6-羥基多巴（即為6-OHDA）注射進大鼠右側文狀體做成偏側PD大鼠模型。在造模2個月后，將黑質致密度部神經元與小膠質細胞數目加以計數。應用免疫組織化學法監測黑質致密部白介素的表達水平改變情況。結果在光鏡視下，注意模型組大鼠右側黑質致密部多巴胺能神經元已消失，而小膠質細胞計數數目顯著性增多，和假手術組、正常對照組比較差異P＜0.05，有統計學意義。免疫組化染色發現模型組大鼠右側黑質致密部可以看見顯著的小膠質細胞核周圍存在白介素的表達，為棕褐色。但是模型組在左側黑質，假手術組及正常對照組在右側黑質未發現顯著的白介素表達。結論嗜神經毒素6-OHDA能促使神經元釋放出小膠質細胞并激活態物質，小膠質細胞被激活釋放出白介素產生介導細胞毒性的作用，加快神經元發生慢性變形壞死現象。

小膠質細胞；白介素；帕金森病；發病機制；實驗研究

帕金森病（簡稱PD）的致病因素和發病機制還未十分清楚。最近階段研究提出腦內炎癥反應主要是細胞因子的形成及釋放，小膠質細胞被激活后可能會參與PD的發病[1]。本組實驗利用文狀體雙靶點將神經毒素6-OHDA注入大鼠體內做成PD大鼠模型，注意小膠質細胞數目水平的變化及包借宿于黑質致密部中的表達情況，進而研究免疫細胞因子與小膠質細胞于PD發病機制中發揮的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 雄性健康的大鼠 34只，平均體重（210±12）g，隨機將其分成三組，模型組18只，假手術組8只，正常對照組8只。

1.2 方法

1.2.1 選取標本 用 10%濃度的水合氯醛進行麻醉以后，先后在心腔內灌注生理鹽水與4%濃度的多聚甲醛進行內固定，斷頭取其腦。標本在10%濃度中性福爾馬林溶液內固定7天，用石蠟加以包埋，然后切片，其片厚是4μm。標本選取前鹵前 0.6mm、前囪后0.2mm層面，和前囪后4.8～5.4mm層面處的不同部位。對黑質致密部多巴胺能神經元與小膠質細胞產生數目加以計數。

1.2.2 白介素免疫組化染色 選用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶法染色，以4μm厚度切片石蠟，然后脫蠟至入水，用PH值為6.0的0.01mmol/L檸檬酸鹽緩沖液加入其內，加熱到98℃進行抗原修復，過氧化氫甲醇加以阻斷，在室溫中孵育。用羊血清對其封閉，在室溫孵育。然后加入特異性白介素，置于4℃環境過夜。再加生物素化二抗，于室溫中孵育。添加鏈霉素康生物素-過氧化物酶溶液，在室溫中孵育，用DAB進行顯色。用蘇木素進行襯染。用PBS代替陰性對照一抗[2]。

1.3 統計學方法采用實驗數據用（±s）表示，全部數據在統計學軟件SPSS 14.0上加以處理，模型組中大鼠左、右側比較應用配對t加以檢驗，組建數據比較應用單因素χ2檢驗。

2 結果

2.1 黑質致密部神經元細胞數目詳見表1。模型組大鼠右側顯著降低，和假手術組大鼠右側與正常對照組大鼠右側比較，差異P＜0.05有統計學意義。

表1 三組大鼠黑質致密帶多巴胺能神經元數目的計數情況表(±s)

表1 三組大鼠黑質致密帶多巴胺能神經元數目的計數情況表(±s)

組別 例數 左側 右側模型組 18 98.21±20.86 31.71±15.94假手術組正常對照組88 109.66±11.44 93.32±10.77 118.16±21.97 101.82±16.24

2.2 黑質致密部小膠質細胞數目的計數情況詳見表2。模型組大鼠右側顯著增多，和假手術組大鼠右側與正常對照組大鼠右側比較，差異P＜0.05有統計學意義。

表2 三組大鼠黑質致密部小膠質細胞數目的計數情況表(±s)

表2 三組大鼠黑質致密部小膠質細胞數目的計數情況表(±s)

組別 例數 左側 右側模型組 18 31.11±3.12 60.21±9.94假手術組正常對照組88 33.02±4.75 36.31±6.29 33.82±4.25 34.49±5.10

2.3 病理學觀察

2.3.1 黑質致密部HE染色 在模型組大鼠左側黑質致密部存在大量多巴胺能神經元，其包體包漿為嗜伊紅染色和條帶狀排列。而模型組大鼠右側黑質致密部沒有多巴胺能神經元，且殘留的神經元出現萎縮，其條帶狀排列不顯著。

2.3.2 白介素黑質致密部免疫組織學染色 在模型組大鼠右側黑質致密部能看見顯著棕褐色呈陽性表達，主要分布于梭形、短桿形以及三角形的小膠質細胞核周。但是模型組大鼠左側無顯著的陽性染區。假手術組和正常對照組大鼠左、右側黑質區無顯著陽性染區。

3 討論

帕金森病（PD）致病因素和發病機制多是利用動物模型實驗完成的，現階段還沒有完美理想的模型。本組實驗應用紋狀體內雙靶點6-OHDA的注射方法，利用神經元軸突具有的逆行性吸收作用，將黑質損壞。在實驗中注意模型組在注藥一側黑質多巴胺能神經元比假手術組和正常對照組顯著降低。在PD患者中，黑質特異性的小膠質細胞被高度激活及陽性表達。本組實驗注意模型組大鼠右側黑質小膠質細胞的計數增多，且使用免疫組織化學法驗證了小膠質細胞在胞漿中有白介素表達，也證實了小膠質細胞介導損害了多巴胺能神經元產生的炎性反應[3]。在PD動物模型中，其小膠質細胞被激活以后，產生的白介素于損傷一側黑質致密部的實驗表達存在特異性。表明其介導損害的神經元有攻擊作用。促進神經元的變性及死亡。但是很可能是PD免疫受損的原因之一。小膠質細胞受T淋巴細胞的影響，產生其它的大量物質，主要是誘發炎癥、活性氮類及活性氧類的前列腺素，而此類化學物質也對神經變性具有促動作用。

通過本組實驗可知，PD發病過程中，小膠質細胞和被激活出現的免疫細胞因子對注藥側黑質多巴胺能神經元產生毒性作用。其免疫反應致使PD為慢性病程給予了實驗依據，進一步給臨床中使用抑制免疫類藥物提供參考支持。

[1] 董麗華,胡國華.神經膠質細胞在帕金森病發病機制中的作用[J].中風與神經疾病雜志,2010,21(4):338-340.

[2] 周媛,李潔,劉春風.小膠質細胞在帕金森病發病學中的作用[J].國外醫學(老年醫學分冊),2010,26(5):211-212.

[3] 裴正斌,彭國光.小膠質細胞在帕金森病中的雙重作用[J].中國臨床康復,2010,8(1):130-131.

R742.5

A

1673-5846(2014)01-0216-02

1 牡丹江醫學院，黑龍江牡丹江 157011

2 牡丹江醫學院紅旗醫院，黑龍江牡丹江 157011

黑龍江省教育廳科學技術研究項目，編號：12531734

楊曉帆，E-mail：qingqingfanying@sina.com。