高效液相色譜法測(cè)定煙酸洛伐緩釋片有關(guān)物質(zhì)的含量

章彩霞 黃秀清 金靈華

高效液相色譜法測(cè)定煙酸洛伐緩釋片有關(guān)物質(zhì)的含量

章彩霞 黃秀清 金靈華

目的建立高效液相色譜法測(cè)定煙酸洛伐緩釋片有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法。方法采用C18柱，以甲醇:0.4%磷酸溶液（80:20）為流動(dòng)相。采用自身對(duì)照法對(duì)洛伐他汀的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)；以甲醇:0.05mol/l磷酸二氫鈉溶液（磷酸調(diào)PH值至 2.5）（10:90）為流動(dòng)相，對(duì)煙酸進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。結(jié)果在建立的色譜條件下，洛伐他汀、煙酸峰與其相關(guān)雜質(zhì)峰均能完全分離。結(jié)論本法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，符合有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)驗(yàn)證要求，適用于本品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。

洛伐他汀；煙酸；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)

煙酸洛伐緩釋片由速釋的洛伐他汀層和緩釋的煙酸層組成，兩種藥物聯(lián)用，對(duì)改善低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和甘油三酯的作用比單方制劑效果更優(yōu)，安全性高，特別適用于混合型高血脂癥患者。本文采用兩種不同的色譜體系，分別對(duì)煙酸洛伐緩釋片中洛伐他汀和煙酸進(jìn)行了雜質(zhì)歸屬分析，建立了一種煙酸洛伐緩釋片的反相高效液相色譜（HPLC）法控制有關(guān)物質(zhì)的方法。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，適用于煙酸洛伐緩釋片有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

1 儀器與試藥

安捷倫科技有限公司的Agilent 1100型高效液相色譜儀，配LC-10AT泵，安捷倫上海分公司6010型，上海精密科學(xué)儀器有限公司PHS-3C型酸度計(jì)，北京賽多利斯天平有限公司BS 110S型電子天平，乙腈（色譜純，臨海市浙東特種試劑廠）、甲醇（色譜純，臨海市浙東特種試劑廠），磷酸二氫鈉（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），庚磺酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、磷酸（分析純），純化水煙酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物檢定所，100434-200301），洛伐他汀對(duì)照品（中國(guó)藥品生物檢定所，100600-200502），煙酸洛伐緩釋片（自制，20101008、20101009、20101010）。

2 方法與結(jié)果

2.1 洛伐他汀有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（80:20）；流速：1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl。洛伐他汀峰與有關(guān)雜質(zhì)峰分離度均大于2，理論塔板數(shù)按洛伐他汀峰計(jì)算不低于3000。

2.1.2 測(cè)定方法 取本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于洛伐他汀20mg），置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻?yàn)V過(guò)，取續(xù)濾液5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品。精密量取上述供試品溶液1ml，置100ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取對(duì)照溶液20μl，注入色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。取供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄譜圖至主峰保留時(shí)間的3倍。

2.1.3 專屬性試驗(yàn) 取洛伐他汀約0.1g，置100ml量瓶中，用甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，得儲(chǔ)備液，取5ml儲(chǔ)備液置25ml量瓶分別進(jìn)行光照、高溫、酸、堿、氧化破壞，另取按處方比例配置的輔料空白樣品和取按處方比例配置的除洛伐他汀的空白樣品，依法配置，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。取上述溶液分別進(jìn)樣20μl，照2.1.2項(xiàng)方法檢查，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果表明：本品在洛伐他汀的有關(guān)物質(zhì)檢查中輔料和煙酸對(duì)檢查無(wú)干擾，樣品經(jīng)酸、堿、高溫、光照、氧化破壞后均有降解，降解產(chǎn)物和洛伐他汀主峰分離完全。

圖1 洛伐他汀堿破壞

圖2 煙酸洛伐緩釋片洛伐他汀有關(guān)物質(zhì)

圖3 洛伐他汀有關(guān)物質(zhì)對(duì)照

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別于0h、1h、2h、4h、8h、10h進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明：洛伐他汀主峰面積 6480102、6430846、6389413、6376920、6374465、6345214的RSD（n=6）為0.75%，本品在甲醇溶液中較穩(wěn)定，可以在10h內(nèi)使用。

2.1.5 檢測(cè)限 取上述儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋，取20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，當(dāng)信噪比為3:1（S/N=3）時(shí)，進(jìn)樣濃度為3μg/ml，所以在本色譜系統(tǒng)條件下，最低檢測(cè)濃度為3μg/ml。

2.1.6 樣品測(cè)定 取3批樣品細(xì)粉適量，照2.1.2項(xiàng)方法檢查，記錄色譜圖（圖 2、3），扣除相對(duì)保留時(shí)間（按洛伐他汀峰計(jì)）為3.23的煙酸峰及之前的溶劑峰，供試品溶液中任何小于對(duì)照品溶液主峰面積0.1倍時(shí)忽略不計(jì)，單個(gè)雜質(zhì)不得大于對(duì)照溶液主峰面積（1.0%），總雜質(zhì)峰面積的總和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的2倍（2%）。結(jié)果：3批煙酸洛伐緩釋片的洛伐他汀有關(guān)物質(zhì)含量分別為0.82%、0.78%、0.85%。

2.2 煙酸有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

2.2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Angilent C18柱；流動(dòng)相：甲醇:0.05mol/l磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)PH值至2.5）=10:90為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：262nm；流速：1.0mg/ml；柱溫：30℃；理論塔板數(shù)按煙酸計(jì)算不低于3000，煙酸峰與各雜質(zhì)峰峰分離度應(yīng)符合要求。

2.2.2 測(cè)定方法 本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于煙酸50mg），精密稱定，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲溶解10min，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品，取對(duì)照品溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%，精密量取供試品溶液20μl注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 取煙酸0.5g置100ml量瓶中，加流動(dòng)相適量溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得儲(chǔ)備液，取5份5ml儲(chǔ)備液置25ml量瓶，進(jìn)行光照、高溫、酸、堿、氧化破壞，取所得溶液和依法配置的輔料空白溶液和除煙酸的空白溶液分別進(jìn)樣20μl，記錄色譜圖（圖4）。結(jié)果表明：輔料及洛伐他汀對(duì)本品中煙酸的有關(guān)物質(zhì)檢查無(wú)干擾，對(duì)酸、堿、光照、高溫穩(wěn)定，氧化有一定的破壞作用，產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰分離完全，本法專屬性強(qiáng)，可用于煙酸有關(guān)物質(zhì)檢查。

2.2.4 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液分別于0h、1h、2h、4h、8h、24h進(jìn)樣，記錄色譜圖，煙酸峰面積分別 7479413、7490602、7484988、7495882、7492765、7472268，RSD為0.12，結(jié)果表明：煙酸供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 檢測(cè)限 取煙酸對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，取20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，當(dāng)信噪比為3:1（S/N=3）時(shí)，進(jìn)樣濃度為0.8μg/ml，所以在本色譜系統(tǒng)條件下，最低檢測(cè)濃度為0.8μg/ml。

2.2.6 樣品測(cè)定 取3批樣品細(xì)粉，按2.2.2項(xiàng)方法測(cè)定，供試品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照品峰面積的0.2倍（0.2%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積1倍（1.0%），記錄色譜圖（圖 5、6）試驗(yàn)結(jié)果表明 3批樣品均未檢出雜質(zhì)。

圖4 煙酸氧化破壞

圖5 煙酸有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

圖6 煙酸對(duì)照

3 討論

3.1 本文在相關(guān)文獻(xiàn)和制劑工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)該公司產(chǎn)品煙酸洛伐緩釋片進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量研究工作，建立了煙酸洛伐緩釋片的有關(guān)物質(zhì)檢查 HPLC法。在《中國(guó)藥典》，煙酸含量測(cè)定采用紫外-可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定[1]，未見(jiàn)有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，本品是由洛伐他汀和煙酸組成的復(fù)方制劑，雜質(zhì)很可能來(lái)源于兩個(gè)主成分的降解產(chǎn)物，因此建立了煙酸的色譜體系，對(duì)煙酸的雜質(zhì)也進(jìn)行了歸屬研究。通過(guò)在兩種色譜條件下，分別對(duì)洛伐他汀和煙酸進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)考察，對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行了初步的歸屬分析，結(jié)果表明煙酸基本沒(méi)有雜質(zhì)產(chǎn)生，供試品中的雜質(zhì)均由洛伐他汀產(chǎn)生，主要為加氫洛伐他汀和辛伐他汀。

3.2 溶劑的選擇由破壞性試驗(yàn)可知，洛伐他汀在酸、堿、光照、高溫條件下均不穩(wěn)定，煙酸較穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)洛伐他汀酸性和堿性條件下均易降解。參考中國(guó)藥典[1]和國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[2]，選擇了甲醇、乙腈、甲醇:醋酸鈉緩沖液（80:20）作為溶劑，對(duì)洛伐他汀和煙酸在3種溶劑中的溶解度及在相應(yīng)溶液中的穩(wěn)定性、緩釋片在溶液中的分散性做了考察，結(jié)果表明，洛伐他汀在甲醇和乙腈中的溶解度、緩釋片在兩種溶劑中的分散性、洛伐他汀在兩種溶液中的穩(wěn)定性基本相同，洛伐他汀在甲醇：醋酸鈉緩沖液（80:20）不穩(wěn)定，考慮到成本因素，選擇甲醇作為洛伐他汀有關(guān)物質(zhì)的溶劑。

3.3 洛伐他汀流動(dòng)相的選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]，目前洛伐他汀流動(dòng)相系統(tǒng)一般為乙腈-水和甲醇-水系統(tǒng)，流動(dòng)相中控制PH值為弱酸性，其主要目的是為了避免載體硅膠對(duì)洛伐他汀的雜質(zhì)——開(kāi)環(huán)的洛伐他汀羧基酸（也稱加氫洛伐他汀，是洛伐他汀的降解產(chǎn)物）作用而引起拖尾的影響。分別考察弱酸性條件下乙腈水系統(tǒng)和甲醇水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)兩種系統(tǒng)的分離度大致相同，為了節(jié)約成本，采用甲醇-0.4%磷酸水溶液（80:20）為流動(dòng)相。

3.4 煙酸流動(dòng)相選擇實(shí)驗(yàn)中選擇不同的流動(dòng)相：甲醇-0.2mol/l庚磺酸鈉溶液（80:20）[4]、乙腈:0.05mol/l磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào) PH值至2.5）=1:99[5]，甲醇:0.05mol/l磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)PH值至2.5）=10:90做流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)峰型好，保留時(shí)間適當(dāng)，確定其為最佳流動(dòng)相。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京,2010: 614.

[2] 郭瑞峰,郄冰冰,張西如,等.高效液相色譜法法測(cè)定洛伐他汀片劑的有關(guān)物質(zhì)[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2009(15):12-13.

[3] 文鏡,劉迪,金宗濂.洛伐他汀檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào),2003,17(3).

[4] 韓宇,金立弟,高旭馨.HPLC法測(cè)定復(fù)方氨基丁酸維E膠囊中維生素B1和煙酸的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2012,13(4):271-274.

[5] 譚建平,陳禧翎,鄭思嘉.HPLC法測(cè)定煙酸注射液中煙酸的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào),2012,18(12):1785-1788.

R927.2

A

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浙江迪耳藥業(yè)有限公司，浙江金華 321016

章彩霞（1978.9-），女，浙江省金華人，工程師，本科學(xué)歷，研究方向：藥學(xué)和藥物分析。