阿哌沙班片微生物限度檢查方法驗證

范新風(fēng)

（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，北京 100041）

阿哌沙班片微生物限度檢查方法驗證

范新風(fēng)

（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，北京 100041）

目的建立阿哌沙班片微生物限度檢查方法。方法細(xì)菌計數(shù)采用離心法聯(lián)合薄膜過濾法；霉菌及酵母菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法；控制菌大腸埃希菌采用常規(guī)法。結(jié)果在3次獨立的平行試驗中，5株試驗菌的回收率均＞70%，符合驗證要求。結(jié)論該微生物檢查法消除了樣品的抑菌性，可用于該品種的微生物限度檢查。

阿哌沙班片；微生物限度檢查；方法學(xué)驗證

阿哌沙班是口服Xa因子直接抑制劑，繼達(dá)比加群酯和利伐沙班后上市，用于擇期髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的成年患者，以預(yù)防靜脈血栓形成[1]。

按阿哌沙班片國家食品藥品監(jiān)督管理局進口標(biāo)準(zhǔn)藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)：JX20120076微生物限度檢查法進行試驗：其中細(xì)菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），霉菌及酵母菌計數(shù)采用平皿法，控制菌采用常規(guī)法。結(jié)果顯示：枯草芽孢桿菌回收率為0%，有明顯抑菌性；白色念珠菌回收率僅為67%，有抑菌性。大腸埃希菌回收率98%，金葡菌回收率93%，黑曲霉回收率89%。控制菌檢查試驗組和陽性對照組陽性菌生長良好，證明該方法專屬性良好。由實驗結(jié)果可以得出，進口注冊標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌計數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)方法不適用筆者公司生產(chǎn)的阿哌沙班片的微生物限度檢查。因此，為保證藥品的質(zhì)量和臨床用藥安全，保證方法的準(zhǔn)確和可靠性，按《中藥藥典》2010版附錄XIJ，進行阿哌沙班片微生物限度檢查方法驗證。

1 試驗材質(zhì)

1.1 試驗樣品：阿哌沙班片（規(guī)格：5 mg；批號：130401、130402、130403本公司生產(chǎn)）。

1.2 稀釋劑與培養(yǎng)基：pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（自制）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（101124）、改良馬丁培養(yǎng)基（130409）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（110616）玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（1210184）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（1204192）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）（121023）。以下培養(yǎng)基均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.3 試驗菌株：枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC （F） 98001]以上菌株均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4 儀器：BSC-1300 IA2生物安全柜（蘇靜泰安空氣技術(shù)有限公司）、SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州美迪凈化工程有限公司）、LSB35L-I立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、RJTDL-40B低速臺式大容量離心機（無錫市瑞江儀器分析有限公司）、LRH-250F生物培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、JJ500電子天平（常熟市雙杰儀器廠）、直徑90 cm培養(yǎng)皿、移液管等。

2 方法與結(jié)果[1]

2.1 預(yù)試驗小結(jié)：按阿哌沙班片國家食品藥品監(jiān)督管理局進口標(biāo)準(zhǔn)藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)：JX20120076微生物限度檢查法進行試驗：其中細(xì)菌采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），霉菌及酵母菌采用平皿法，控制菌采用常規(guī)法。結(jié)果顯示：枯草芽孢桿菌回收率為0%，有明顯抑菌性；白色念珠菌回收率僅為67%，有抑菌性。大腸埃希菌回收率98%，金葡菌回收率93%，黑曲霉回收率89%。控制菌檢查試驗組和陽性對照組陽性菌生長良好，證明該方法專屬性良好。

為消除樣品對枯草芽孢桿菌的抑菌，分別采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）、薄膜過濾法進行試驗，計算枯草芽孢桿菌回收率：

方法1：取1∶10供試液采用離心法聯(lián)合培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）進行試驗，回收率為67%。方法2：取1∶10供試液采用離心法聯(lián)合薄膜過濾法，沖洗3次，每次100 mL進行試驗，回收率為69%。方法3：取1∶10供試液采用離心法聯(lián)合薄膜過濾法，沖洗5次，每次100 mL進行試驗，回收率為88%。

白色念珠菌采用1∶10儲備液培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）進行試驗，回收率為99%。經(jīng)試驗，采用薄膜過濾法，當(dāng)沖洗5次，每次100 mL，枯草芽孢桿菌回收率＞70%，采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿），白色念珠菌回收率＞70%。

綜上所述，阿哌沙班片擬采用下述方法進行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)的方法學(xué)驗證試驗及菌落計數(shù)。細(xì)菌計數(shù)：取1∶10供試液采用離心法聯(lián)合薄膜過濾法，沖洗5次，每次100 mL進行驗證；霉菌及酵母菌計數(shù)：取1∶10供試品儲備液采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）進行驗證。控制菌采用常規(guī)法進行。

2.2 計數(shù)方法驗證

2.2.1 菌液制備：接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL營養(yǎng)肉湯中，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，取此培養(yǎng)液1 mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數(shù)約為50～100 cfu/mL；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28 ℃培養(yǎng)24～48 h，取此培養(yǎng)液1 mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數(shù)約為50～100 cfu/mL；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28 ℃培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。吸出菌液，取1 mL菌液加含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4～10-6，使菌數(shù)約為50～100 cfu/mL。

2.2.2 供試液的制備：取供試品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振搖，作為1∶10的供試品儲備液。取1∶10的供試品儲備液50 mL，500轉(zhuǎn)/分離心3 min，取全部上清液作為1∶10的供試液[2]。

2.2.3 驗證方法：按照《中國藥典》2010年版二部微生物限度檢查法進行計數(shù)方法驗證，驗證試驗至少進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。①菌液組：分別取菌液1 mL，采用平皿計數(shù)法，測定上述制備好的菌液中每毫升的活菌數(shù)，測定結(jié)果見表1。②供試品對照組：細(xì)菌計數(shù) 取1 mL的1∶10供試液，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，沖洗5次，每次100 mL。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于已凝固好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35 ℃培養(yǎng)3 d，測定供試品本底的細(xì)菌數(shù)。測定結(jié)果見表1。霉菌和酵母菌計數(shù)：取1∶10供試品儲備液1 mL，分別注入5個平皿，每皿0.2 mL，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置20～25 ℃培養(yǎng)5 d觀察結(jié)果。測定供試品本底的霉菌和酵母菌數(shù)。測定結(jié)果見表1。③試驗組。細(xì)菌計數(shù)：取1 mL的1∶10供試液，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，沖洗5次，每次100 mL。在最后一次沖洗液中加入上述菌液（50～100 cfu試驗菌），沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于已凝固好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35 ℃培養(yǎng)3 d，觀察結(jié)果。測定結(jié)果見表1，回收率見表1。霉菌和酵母菌計數(shù)：取1∶10供試品儲備液0.2 mL和上述真菌菌液1 mL（50～100 cfu試驗菌），分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置20～25 ℃培養(yǎng)5 d觀察結(jié)果。測定結(jié)果見表1，回收率見表1。④稀釋劑對照組：分別取10 mL上述細(xì)菌菌液（500～1000 cfu試驗菌），500轉(zhuǎn)/分離心3 min，取上清液作為稀釋劑對照液。取稀釋劑對照液1 mL，加至100 mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，沖洗5次，每次100 mL，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于已凝固好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，置30～35 ℃培養(yǎng)3 d觀察結(jié)果。測定結(jié)果見表2，回收率見表2。

2.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)：在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的的菌數(shù)回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70%；試驗組的菌數(shù)回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70%。

2.2.5 測定結(jié)果：見表1和表2。

表1 計數(shù)方法驗證結(jié)果

表2 稀釋劑對照組回收率測定結(jié)果

結(jié)論：經(jīng)上述試驗驗證，在三次的獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的回收率、試驗組的回收率均不低于70%；可采用離心法聯(lián)合薄膜過濾法進行本品的細(xì)菌計數(shù)，采用培養(yǎng)基稀釋法進行本品的霉菌和酵母菌計數(shù)[3]。

2.3 控制菌檢查：按照《中國藥典》2010年版二部微生物限度檢查法進行控制菌的方法學(xué)驗證試驗及檢查。

2.3.1 菌液制備：接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL營養(yǎng)肉湯中，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，取此培養(yǎng)液1 mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使細(xì)菌數(shù)約為10～100 cfu/ mL。

2.3.2 供試液的制備：取供試品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振搖，作為1∶10的供試品儲備液。取1∶10的供試品儲備液50 mL，500轉(zhuǎn)/分離心3 min，取全部上清液作為1∶10的供試液。

2.3.3 驗證方法：①試驗組：取1∶10供試液10 mL，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 mL中，加入大腸埃希菌10～100 cfu，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物0.2 mL，加入含5 mL的4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）試管中，置30～35 ℃培養(yǎng)于5、24 h觀察結(jié)果，見表3。②陽性對照組：取大腸埃希菌10～100 cfu，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 mL中，作陽性菌對照，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物0.2 mL，加入含5 mL的4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）試管中，置30～35 ℃培養(yǎng)于5、24 h觀察結(jié)果，見表3。③陰性對照組：取10 mL稀釋劑，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 mL中，作陰性對照，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物0.2 mL，加入含5 mL的4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）試管中，置30～35 ℃培養(yǎng)于5、24 h，觀察結(jié)果，見表3。

表3 控制菌檢查結(jié)果

表3的結(jié)果顯示，試驗組、陽性對照組陽性菌生長良好，陰性對照組無菌生長，表明該控制菌檢查方法的專屬性良好。

結(jié)論：根據(jù)上述驗證試驗結(jié)果，制定本品的微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)如下：微生物限度，取供試品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振搖，使呈1∶10的供試品儲備液， 取1∶10的供試品儲備液50 mL，500轉(zhuǎn)/分離心3 min，取全部上清液作為1∶10的供試液。細(xì)菌計數(shù)采用薄膜過濾法：取1∶10的供試液1 mL，加至100 mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，沖洗5次，每次100 mL，沖洗后取出濾膜，依法檢查（中國藥典2010年版二部附錄XIJ）。霉菌和酵母菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，取1∶10的供試品儲備液1 mL，分別注入5個平皿，每皿0.2 mL，平行制備兩份，依法檢查（中國藥典2010年版二部附錄XIJ）。大腸埃希菌檢查采用常規(guī)法，取1∶10的供試液10 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基，依法檢查（中國藥典2010年版二部附錄XIJ）。1g供試品中，細(xì)菌數(shù)不得過1000個，霉菌和酵母菌數(shù)不得過100個，大腸埃希菌不得檢出。按照該方法檢驗供試品符合規(guī)定，測定結(jié)果見表4。

表4 供試品檢驗結(jié)果

3 討 論

3.1 筆者在建立阿哌沙班片微生物檢查方法時發(fā)現(xiàn)，相同品種制劑，由于原輔料來源差異、工藝差異，會造成微生物檢查方法的不適用。為保證的產(chǎn)品質(zhì)量和臨床用要安全，必須建立適合的方法。同時，筆者認(rèn)為，當(dāng)發(fā)生變更時，如原料變更、產(chǎn)品的組份、原檢驗條件發(fā)生改變，宜必須重新進行驗證，以保證方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

3.2 阿哌沙班片微生物檢查計數(shù)方法驗證，在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的回收率、試驗組的回收率均不低于70%；可采用離心法（500轉(zhuǎn)/分鐘離心3 min）聯(lián)合薄膜過濾法（pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗5次，每次100 mL）進行本品的細(xì)菌計數(shù)，采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.2 mL）進行本品的霉菌和酵母菌計數(shù)。

3.3 對于建立藥品微生物檢查方法，筆者曾做過許多品種驗證，尤其對于有抑菌性制劑，消除產(chǎn)品抑菌性、建立準(zhǔn)確、可靠的檢查方法，筆者認(rèn)為預(yù)實驗是非常必要的。預(yù)實驗?zāi)艹醪阶C明產(chǎn)品對某一種或某幾種菌的抑制，然后，有真對性的進行試驗設(shè)計和正確試驗，即可以節(jié)省時間，又可以針對性的解決問題。同時，對于薄膜過濾法消除抑菌性，筆者認(rèn)為同時可考察不同廠家的濾膜，如頗爾、賽多利斯：以及不同材質(zhì)的濾膜，如混合纖維性濾膜、改良親水性聚醚砜濾膜的。

[1] 王磊,鐘靜芬.口服Xa因子直接抑制劑阿哌沙班的臨床研究進展[J].上海醫(yī)藥,2012,33(17):17-20.

[2] 國家藥典委員會會編.《中國藥典》二部附錄[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:107-116.

[3] 中國藥品生物制品檢定所.《中國藥品標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:351-407.

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1671-8194（2014）34-0063-03