大孔樹脂分離黃杞葉總黃酮的研究

王 芬 張雪玲 李建緒*

（青島市市立醫(yī)院藥學(xué)部，山東 青島 266011）

大孔樹脂分離黃杞葉總黃酮的研究

王 芬 張雪玲 李建緒*

（青島市市立醫(yī)院藥學(xué)部，山東 青島 266011）

目的通過研究確定黃杞葉總黃酮大孔樹脂吸附工藝參數(shù)。方法通過大孔吸附樹脂對(duì)黃杞葉黃酮成分的吸附-洗脫性考察，來確定各工藝參數(shù)。結(jié)果D101樹脂對(duì)黃杞葉總黃酮具有較好分離作用，黃杞葉總黃酮?jiǎng)討B(tài)飽和吸附量為55 mg/g；當(dāng)藥材樹脂比為1∶2，樹脂柱徑高比為1∶7，上樣藥液為水提液，濃度相當(dāng)于生藥濃度0.4 g/mL，以水、10%乙醇、60%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫量分別為10、10和5倍樹脂柱量，收集60%醇洗部分，減壓濃縮至干，即得黃杞葉總黃酮提取物。結(jié)論采用D101樹脂對(duì)黃杞葉總黃酮具有較好分離作用，總黃酮回收率在90%以上。

黃酮；黃杞葉；樹脂

黃杞葉為胡桃科植物黃杞（engelhardtiarox bur ghiana wall）的干燥葉。該植物分布于廣東、廣西、云南等，資源豐富。黃杞總黃酮具有抗凝、降脂、降糖和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用[1-3]。大孔樹脂具有選擇性吸附有機(jī)化合物的能力，可應(yīng)用于中藥有效成分的分離及純化。本文對(duì)大孔樹脂分離黃杞葉總黃酮進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

黃杞葉藥材，產(chǎn)自廣西；DA201、DM301型大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司）；HPD600、HPD700大孔吸附樹脂（滄州寶恩化工有限公司）；DM130、860018、860021型大孔吸附樹脂（山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）；D101、AB-8大孔吸附樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司）。

槲皮素對(duì)照品：批號(hào)10081-9905，供含量測(cè)定，中國(guó)藥品生物制品檢定所；鎂粉：廣州試劑廠，批號(hào)20030510。除高效液相色譜所用試劑為色譜純，工藝考察所用95%乙醇為食用級(jí)酒精外，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)態(tài)吸附-洗脫性能考察：取黃杞葉125 g，加水煎煮至沸騰開始計(jì)時(shí)，每次加10倍量水，煎煮0.5 h，共煮3次。紗布濾過，合并濾液，減壓濃縮至小體積，加水稀釋，并定容至250 mL，搖勻，即得。分別稱取各種型號(hào)新購(gòu)的大孔吸附樹脂10 g兩份，一份60 ℃干燥至恒重，得干樹脂質(zhì)量，另一份加入95%乙醇50 mL浸泡12 h，濕法裝柱（φ15 mm ×300 mm），用水反洗樹脂柱，至洗液澄清為止。續(xù)用95%乙醇洗脫，洗至流出液在試管中用水稀釋（1∶1）澄清為止。最后樹脂柱用水洗至流出液無醇味，色譜柱備用。將25 mL樣品液（相當(dāng)于生藥濃度0.5 g/mL）分別通過7種不同型號(hào)的已處理好的大孔吸附樹脂柱，以5 mL/min的流速進(jìn)行吸附，殘留液重復(fù)吸附2次（用鹽酸-鎂粉檢測(cè)，殘留液保證吸附過量），接著用水洗至無色，最后用60%乙醇洗至鹽酸-鎂粉反應(yīng)至陰性；依次接收殘留液，水洗脫液和醇洗脫液，分別減壓濃縮至小體積，加50%甲醇定容至25 mL。分別進(jìn)行總黃酮的測(cè)定，計(jì)算上柱量（即飽和吸附量），比吸附量，比洗脫量。比上柱量＝（樣品黃酮量-殘留液黃酮量）/干樹脂質(zhì)量；比吸附量＝（樣品黃酮量-殘留液黃酮量-水洗脫液黃酮量）/干樹脂質(zhì)量；比洗脫量＝醇洗脫液黃酮量/干樹脂質(zhì)量。

2.2 洗脫液乙醇濃度的考察：取黃杞葉水提取液20 mL（相當(dāng)于生藥0.4 g/mL），通過預(yù)處理好的樹脂（相當(dāng)于干樹脂10 g），用300 mL水洗脫后，依次用10%、20%、40%、60%、80%乙醇洗脫，各濃度分別收集100 mL及50 mL洗脫液，并將水洗液濃縮至100 mL，各溶液取樣，測(cè)定后余下的溶液蒸干，干燥恒重。計(jì)算出膏率及總黃酮洗脫率、含量。洗脫率＝醇洗脫黃酮量/上柱黃酮量×100%；含量＝醇洗脫黃酮量/醇洗脫液干浸膏×100%。

2.3 藥材量與樹脂比的考察：根據(jù)D101型號(hào)樹脂的比吸附量，按比吸附值的1、1/2、1/3、1/5的比例設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，則分別吸取水提取液10 mL（相當(dāng)于生藥0.4 g/mL），各自通過預(yù)處理好的D101樹脂柱（φ15 mm ×300 mm），樹脂為5、10、15、25 g；以吸附流速2 mL/min上樣，靜態(tài)吸附30 min后，取水適量洗脫至近無色，接著用60%乙醇洗脫，洗脫流速為5 mL/min，收集HCl-Mg反應(yīng)呈陽性的流出液，各溶液減壓濃縮，加50%甲醇定容至100 mL，測(cè)定總黃酮量，余下溶液蒸干，干燥至恒重，計(jì)算洗脫率和含量。

2.4 色譜柱徑高比的考察：選擇不同規(guī)格的玻璃層析柱（φ130 mm× 500 mm，φ222 mm×500 mm，φ320 mm×500 mm，φ417 mm× 500 mm），濕法裝上預(yù)處理好的大孔吸附樹脂（樹脂30 g），則色譜柱的徑高比在1∶3、1∶7、1∶10、1∶15，根據(jù)藥材樹脂的最佳比列為1∶2，取S-06水提取液30 mL（相當(dāng)于生藥0.4 g/mL）過柱。按上述方法吸附-洗脫，對(duì)洗脫液進(jìn)行測(cè)定。

2.5 上樣藥液濃度的考察：在藥材樹脂比為1∶2，色譜柱徑高比為1∶7條件下，分別取總黃酮含量為5.42、10.84、21.68、43.36 mg/mL的水提取液20、10、5、2.5 mL（相當(dāng)于生藥0.2、0.4、0.8、1.6 g/mL）進(jìn)行吸附洗脫實(shí)驗(yàn)。按前述方法進(jìn)行吸附洗脫，取各洗脫液進(jìn)行測(cè)定。

2.6 樹脂重復(fù)利用對(duì)黃杞葉總黃酮回收率的影響：按上述確定條件，取水提取液進(jìn)行上柱、吸附、洗脫，在同一根樹脂柱上重復(fù)操作7次。樹脂每次使用完后采用常規(guī)方法進(jìn)行處理，即：用2倍柱體積的95%乙醇和水反復(fù)沖洗2次，最后洗至無醇味，備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同型號(hào)大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附-洗脫性能考察：不同型號(hào)的大孔吸附樹脂，對(duì)各類成分的吸附性能會(huì)有明顯的差別?？紤]到效率和實(shí)際應(yīng)用情況，對(duì)7種大孔吸附樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附-洗脫性能考察，以比上柱量、比吸附量、比洗脫量為指標(biāo)，綜合考慮，選擇對(duì)總黃酮具有特異富集純化能力，且對(duì)黃酮能快速集中的進(jìn)行洗脫，低成本的樹脂型號(hào)。見表1、圖1。

表1 7種不同型號(hào)大孔吸附樹脂的吸附-洗脫性能比較

圖1 樹脂對(duì)黃杞葉中黃酮成分的吸附和洗脫量

DA201型號(hào)樹脂比吸附量最大，為56.10 mg/g；DM301樹脂比吸附量最小，只有10.34 mg/g；D101樹脂比洗脫量最大，為49.38 mg/g；860018樹脂比洗脫量最小，為23.01 mg/g。從比吸附量和比洗脫量來看，性能最好的前三種樹脂型號(hào)為D101，860021，DM130，均屬于弱極性類型的大孔吸附樹脂，這三種型號(hào)樹脂對(duì)黃杞葉總黃酮有良好的吸附、洗脫性能。

3.2 洗脫液乙醇濃度的考察：黃杞葉黃酮主要集中于40%～60%乙醇部分，黃酮收率共有83%，含量達(dá)22%；水洗脫及其他濃度乙醇洗脫液中沒有測(cè)出總黃酮，而水洗能除去大部分的雜質(zhì)，干浸膏占所有洗脫液干浸膏的48%。說明60%乙醇能快速集中的將S-06中黃酮洗脫下來。洗脫程序確定為：水洗脫至無色后，用60%乙醇洗脫，收集HCl-Mg反應(yīng)呈陽性的流份。見圖2。

圖2 不同濃度乙醇洗脫液中總黃酮洗脫率及含量的考察

3.3 藥材量與樹脂比的考察：60%乙醇對(duì)D101型大孔吸附樹脂洗脫S-06總黃酮的效果在藥材樹脂比例為1∶2時(shí)最好。樹脂使用量在飽和吸附所需量2倍以上時(shí)，洗脫率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，分析原因可能是樹脂柱偏高，而有效成分在動(dòng)態(tài)吸附-解吸附平衡過程中所需時(shí)間加長(zhǎng)，雖然分離效果會(huì)越好，但樹脂柱偏高會(huì)造成有效成分損失、耗時(shí)、高成本等問題，因此選擇藥材樹脂比為1∶2。見圖3。

圖3 不同藥材樹脂比的動(dòng)態(tài)洗脫曲線

3.4 色譜柱徑高比的考察：大孔吸附樹脂色譜柱徑高比在一定程度上影響分離效果，適當(dāng)?shù)膹礁弑燃饶鼙ＷC樹脂柱良好的分離效果和節(jié)省時(shí)間[1]。選擇色譜柱徑高比為1∶3、1∶7、1∶10、1∶15四個(gè)比列進(jìn)行考察。在色譜柱徑高比為1∶3時(shí)，洗脫率只有70%，總黃酮含量為16%；在比例為1∶7時(shí)，洗脫率接近90%，隨色譜柱徑高比的擴(kuò)大，洗脫率增加，在比例為1∶15時(shí)洗脫率達(dá)93%，此時(shí)總黃酮含量為18.7%。見圖4。

圖4 不同色譜柱徑高比的動(dòng)態(tài)洗脫曲線

色譜柱徑高比例越大，洗脫效果越好，在徑高比1∶7以上，洗脫率增長(zhǎng)速度趨于平緩，總黃酮含量變化與洗脫率相似，增長(zhǎng)速率在徑高比1∶7后亦趨于平緩。故本選擇色譜柱徑高比為1∶7。

3.5 上樣藥液濃度的考察：具有相同總黃酮含量的不同濃度的水提取液，具有不同的體積、黏性、pH值等，故對(duì)不同濃度的上柱藥液進(jìn)行考察。黃酮濃度為10.84 mg/mL左右時(shí)（相當(dāng)于生藥濃度0.4 g/mL）時(shí)洗脫率出現(xiàn)拐點(diǎn)，總黃酮洗脫效果最好，上樣濃度過低或過高都會(huì)影響洗脫效果，故最佳上樣濃度可以確定為相當(dāng)于生藥濃度0.4 g/mL。見圖5。

圖5 上樣藥液不同濃度的動(dòng)態(tài)洗脫曲線

3.6 樹脂重復(fù)利用時(shí)對(duì)黃杞葉總黃酮回收率的影響：黃杞葉總黃酮的回收率在前5次樹脂重復(fù)使用中有升高趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了7次考察，樹脂無明顯的變化，表明該大孔吸附樹脂在既定的工藝條件下得到充分的利用，且吸附洗脫性能比較穩(wěn)定[2]。見圖6。

圖6 大孔吸附樹脂重復(fù)利用時(shí)對(duì)總黃酮回收率的影響

4 結(jié) 論

通過大孔吸附樹脂對(duì)黃杞葉黃酮成分的動(dòng)態(tài)吸附-洗脫性能考察，篩選出吸附洗脫黃酮的最佳樹脂型號(hào)D101，對(duì)黃杞葉總黃酮的動(dòng)態(tài)飽和吸附量為55 mg/g。確定的工藝參數(shù)與條件如下：藥材樹脂比為1∶ 2，樹脂柱徑高比為1∶7，上樣藥液為水提液[3]，濃度相當(dāng)于生藥濃度0.4 g/mL，以水、10%乙醇、60%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫量分別為10、10、5倍樹脂柱量，收集60%乙醇洗部分，減壓濃縮至干，即得黃杞葉總黃酮提取物，總黃酮回收率在90%以上，同時(shí)樹脂可以重復(fù)使用7次以上。

[1] 鐘正賢,周桂芬,陳學(xué)芬,等.黃杞總黃酮活血化瘀作用研究[J].廣西中醫(yī)藥,1999,22(4):45-48.

[2] 潘照斌,李棐朝,廖月娥,等.黃杞葉總黃酮對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血保護(hù)作用的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(5):223-226.

[3] 鐘正賢,周桂芬,陳學(xué)芬,等.黃杞總黃酮的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2000,11(6):495-496.

The Research of Engelhardtia Leaves Flavonoids Macroporous Resin Separation

WANG Fen, ZHANG Xue-ling, LI Jian-xu*
(Department of Pharmacy, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, China)

ObjectiveTo get an efficient preparative separation process of flavonoid crude extracts of leaves of Engelhardtia roxburghiana wall.MethodThe optimum resin was to chosen through the researches of their character of adsorption and desorption of FEE.ResultsD101 resin offers the best adsorption capacity, and adsorption and desorption ratios. The dynamic adsorption capacity D101 resin was 55 mg/g. The adsorption and desorption experiments have been carried out on a D101 resin packed column to get the optimal separation process of FEE. The crude material and resin ratio is 1∶2, the hight and diameter ratio is 1∶7, the solution concentration equal to crude material is 0.4 g/mL. The aquatic extract was applied to column, washed by sixcolumn volumes of water, 10 sixcolumn volumes of 10% alcohol, 5 sixcolumn volumes of 60% alcohol successively. The part of 60% alcohol was collected and concentrated by vacuum drying method to get FEE.ConclusionsD101 resin offers the best adsorption capacity, and adsorption and desorption ratios of FEE. This D101 resin method provides a potential approach for large-scale separation and purification of FEE with recovery of 90% higher.

Flavonoid; Leaves of Engelhardtia roxburghiana wall; Resin

R282.710.3

B

1671-8194（2014）34-0022-03

*通訊作者：E-mail： yanshu023@163.com