整合素連接激酶在大鼠阿霉素腎病模型中的表達

賀德剛* 楊曉萍

（1 廈門大學附屬第一醫院杏林分院內科，福建 廈門 361000；2 石河子大學醫學院第一附屬醫院腎病科，新疆 石河子 832008）

整合素連接激酶在大鼠阿霉素腎病模型中的表達

賀德剛1* 楊曉萍2

（1 廈門大學附屬第一醫院杏林分院內科，福建 廈門 361000；2 石河子大學醫學院第一附屬醫院腎病科，新疆 石河子 832008）

目的動態觀察大鼠阿霉素腎病模型中整合素連接激酶（ILK）的表達變化，探討其與腎小球疾病的關系。方法用尾靜脈注射阿霉素建模，用光鏡、電鏡觀察腎臟病理改變，免疫熒光觀察ILK在不同時間點模型組腎組織的表達改變。結果①與對照組比，前4周，模型組24 h尿蛋白量7 d增加，21 d達高峰（P＜0.01）；后8周，模型組24 h尿蛋白量逐漸減少，84 d降到最低值（P＜0.01）；②與對照組比，前4周，模型組腎小球ILK的表達7 d減少，14 d明顯增加（P＜0.05）；后8周，模型組ILK表達逐漸減少（P＜0.05）；③電鏡顯示：前4周模型組大鼠足細胞足突廣泛融合；后8周，模型組足細胞病變進一步加重，出現了其與基底膜的分離、脫落；④足細胞ILK表達的變化與模型組24 h尿蛋白定量的變化呈正相關（r=0.897，P＜0.01）。結論①ILK早期出現表達增加及分布異常，可能是導致蛋白尿的原因及判斷腎小球足細胞損傷的一個早期重要指標。②ILK與蛋白尿呈正相關，其在腎組織中表達的高低對腎臟疾預后的判斷具有一定意義。

阿霉素；蛋白尿；ILK

目前，足細胞損傷的研究已成為探索腎小球疾病發病機制的研究熱點。足細胞是腎臟的固有細胞之一，是腎小球濾過屏障重要組成部分，它在蛋白尿的產生中作用尤為重要。而整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調節細胞增殖、分化、凋亡等中都起重要作用。近年來研究表明ILK在腎小球足細胞中表達水平較高，在維持腎小球基底膜的完整性、介導足細胞與腎小球基底膜黏附、基底膜結構和足細胞功能方面發揮重要作用[1-2]。此實驗用一次性尾靜脈注射鹽酸阿霉素的方法建立大鼠阿霉素腎病模型，測定不同時間點大鼠尿蛋白的量，應用免疫熒光技術和電鏡觀察ILK在不同時間點大鼠腎組織中的表達情況，探討在阿霉素腎病模型中ILK的表達變化與蛋白尿發生的關系。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑：雄性清潔級SD大鼠84只，體質量180～220 g（新疆流行病研究所）。阿霉素（深圳萬樂藥業有限公司）；兔抗ILK抗體（Santa Cruz公司）；羅丹明標記羊抗兔抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.2 動物模型的制備：將SD大鼠隨機分為兩組：對照組、模型組各42只，采用尾靜脈注射阿霉素（濃度2 mg/mL，7.5 mg/kg劑量），建立阿霉素腎病模型，對照組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水[3]。

1.3 大鼠標本收集、檢測：兩組大鼠于建模后第7、14、21、28、42、56、84 d處死，每組各6只。宰殺前1 d用代謝籠留取24 h尿液，宰殺前通過內眥靜脈采血，留取大鼠腎臟組織進行病理檢測。

1.4 腎臟病理觀察：①標本大體觀察；②光鏡觀察：腎臟經福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE、Masson、PAS染色觀察。③電鏡觀察：留取腎皮質組織塊約1 mm3，經戊二醛固定、鋨酸后固定、脫水、環氧樹脂618包埋，超薄切片后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，電鏡觀察。

1.5 腎小球ILK免疫熒光染色及定量分析：大鼠的腎組織經液氮冰凍包埋，在-20 ℃恒冷冰凍切片機以3 μm厚度連續切片，-20 ℃凍存，37 ℃干燥，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS沖洗，10%正常山羊血清封閉1 h，用一抗（抗ILK抗體）在4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，再用二抗（羅丹明標記的抗-兔IgG）在37 ℃孵育1 h，PBS沖洗，DAPI封片。用PBS代替一抗作空白對照。用激光共聚焦掃描顯微鏡（德國ZEISS公司ISM510型）進行單盲讀片，每個標本均采集3個腎小球進行分析。各觀察標本的表達量用Zeiss LSM多功能真彩色圖像分析系統測定腎小球中ILK的平均吸光度值。若信號分布不均勻或節段消失，則視為表達部分缺失，ILK蛋白部分脫落；若陽性信號分布均勻、連續，視為表達完整，ILK蛋白存在。

表1 兩組大鼠各時間點24 h尿蛋白量（mg/24 h）

表1 兩組大鼠各時間點24 h尿蛋白量（mg/24 h）

表2 兩組大鼠各時間點ILK免疫熒光半定量分析

表2 兩組大鼠各時間點ILK免疫熒光半定量分析

1.6 統計學方法：各項指標以均數±標準差表示。實驗數據運用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。多組比較時，若方差齊則采用單因素方差分析；若方差不齊則采用秩和檢驗。用Spearman相關分析方法作指標相關分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 腎小球的病理形態觀察：光鏡、電鏡觀察對照組腎小球的結構正常，足細胞的足突形態正常，無融合或消失，足細胞無脫落。模型組腎小球于第14天可見足細胞足突的形態變化，部分腫脹、融合，系膜細胞稍增多。于第42天，足細胞足突融合或消失明顯，部分基底膜裸露，系膜細胞增生，部分腎小球毛細血管襻出現階段性硬化伴腎小管萎縮，系膜基質增生；第84天，足細胞脫落、消失，腎小球局灶節段性硬化明顯，腎小管萎縮，系膜細胞和系膜基質明顯增生，出現FSGS典型病理改變。

2.2 尿蛋白的變化：兩組大鼠24小時尿蛋白數據統計分析見表1，結果顯示：模型組24 h尿蛋白定量均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。前4周為微小病變階段，模型組24小時尿蛋白從第7天開始增加，于第21天達到高峰，均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。后8周為局灶階段性硬化階段，模型組24 h尿蛋白定量從第42天開始減少，于第84天減到最低，均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 腎臟ILK表達定位分布、熒光形態計量：熒光顯微鏡下觀察到ILK蛋白在腎小球的定位分布規律，對照組ILK沿腎小球基底膜上皮細胞側連續均勻分布，呈線型熒光。模型組可見ILK表達呈點狀或短線狀，基底膜熒光有節段性缺失。

大鼠腎小球ILK表達熒光的形態計量數據統計分析見表2，結果顯示：前4周，模型組腎小球中的ILK表達量在第7天有所減少，但隨著時間的發展，模型組腎小球中的ILK表達量在第14天出現增加，第21天達到最大值，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。后8周為局灶階段性硬化階段，模型組ILK的熒光表達量從第42天開始減少，于第84天減到最低，均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 相關分析：模型組大鼠不同時間點腎小球中ILK的表達量與24 h尿蛋白量之間呈正相關（r=0.897，F=165.528，P＜0.01）。

3 討 論

許多腎臟疾病的主要臨床特征表現為蛋白尿，近年來關于蛋白尿的研究多以足細胞或裂孔隔膜相關蛋白為重點，通過對多種足細胞特異性蛋白分子（nephrin、podocin、P-選擇素等）的研究，在蛋白尿的產生方面取得重大進展[4-5]。而在足細胞中表達水平較高ILK，是1996年發現的一種新的黏附蛋白，屬絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在進化上高度保守。已有研究顯示它與腎臟上皮細胞間質轉化、系膜細胞增殖和系膜基質沉積等過程關系密切。新近研究表明ILK主要以外周方式存在于腎小球，在足細胞呈強染色，對保持腎小球的濾過功能、維持腎小球基底膜的完整性和防止蛋白質的漏出有重要意義[6-8]。

本文用一次性尾靜脈注射阿霉素的方法復制腎病模型，表現為病變的兩個階段。在前四周，表現為大量蛋白尿、低蛋白血癥，與原發性微小病變腎病相似。實驗中通過免疫熒光觀察到對照組腎臟組織中ILK在腎小球的足細胞明顯表達，這與文獻的報道一致[6]。在腎病模型前四周，建立的早期（7 d），模型組大鼠出現蛋白尿、低蛋白血癥，而此時模型組大鼠腎小球ILK的熒光表達量首先下降，可能為阿霉素及其代謝產物造成足細胞損傷所致，但隨著造模時間的延長，模型組腎小球中出現ILK表達量的增加，并于第21天時達最高值，而同時檢測到模型組大鼠尿蛋白的量進一步增加，血漿白蛋白進一步下降。分析其原因，此實驗阿霉素腎病的主要病變部位是腎小球的足細胞，而足細胞具有高度分化、增生能力有限的特點[9-10]。在兒童先天性腎病綜合征芬蘭型（CNF），Kretzler等[11]觀察到CNF的腎小球足細胞ILKmRNA水平增高，在小鼠腎毒性腎炎模型中，足細胞ILK表達增高亦引起足細胞表型改變，與基底膜黏附減少，從基底膜脫落，導致嚴重蛋白尿。Teixeira等[12]發現當腎小球足細胞中ILK活性增加時，可調節整合素的活性和親和力，也引起足突細胞表型改變、足突消失，干擾其與基質的相互作用，使其與腎小球GBM分離、增殖，同時伴有細胞骨架的紊亂，抑制裂孔膜表面的P鈣黏蛋白和CD2AP分子的表達，從而導致腎小球濾過膜的損傷和嚴重蛋白尿。在此阿霉素腎病模型中，足細胞ILK的表達發生了變化，出現了分布異常，免疫熒光結果顯示ILK的分布從沿著腎小球基底膜線樣分布逐漸轉變為不連續性顆粒樣或節段性斑片狀分布，電鏡顯示模型組大鼠出現足細胞足突的腫脹、融合、消失，隨著實驗的進展ILK表達量在21 d出現最高值，而此時蛋白尿也明顯增多，相關性分析顯示模型組腎小球不同時間ILK表達量與24 h尿蛋白量成正相關（r=0.897，F=165.528，P＜0.01）。由此推斷ILK介導足細胞與腎小球基底膜的黏附和蛋白尿的發生。而且通過此實驗觀察到ILK的表達變化早于足細胞損傷和蛋白尿的產生，依次分析ILK可能是判定足細胞損傷和蛋白尿的一個早期指標。

在阿霉素腎病模型后6周，表現為腎小球的局灶性、階段性硬化，腎小管的萎縮，復制了局灶階段性腎小球硬化模型。但隨著造模時間的推移，大鼠腎小球中出現ILK表達量減少，模型組大鼠尿蛋白的量也進一步減少，并于第84天時達最低值。已有研究表明，在一些伴有大量蛋白尿的腎小球疾病中，可以觀察到足細胞數量的減少。足細胞數量減少的原因有：凋亡、脫落、增殖有限、表型轉變[13]。在此模型的后6周，我們觀察到部分腎小球基底膜的增厚，部分基底膜裸露，足細胞數量減少，脫落或消失。Asanuma等[14]研究認為TGF-β1、bFGF 、PDGF等生長因子可以導致局部蛋白酶及其抑制劑的分泌不平衡，蛋白水解活性增加誘導GBM退化，造成足細胞和基底膜連接的損害，啟動足細胞從GBM脫落。Teixeira等[12]研究表明ILK還能促進基質金屬蛋白酶-2，9的分泌，該酶又可導致基底膜的降解，使基底膜完整性受到破壞而產生蛋白尿。在糖尿病腎病患者的腎組織中，Guo等[15]發現ILK在系膜細胞表達顯著增加，與系膜細胞彌漫擴張相關，而在球性硬化和結節性硬化顯著部位，ILK表達減少。在此模型的后6周，損傷進一步加重，出現腎小球的局灶、階段硬化，熒光定量顯示ILK表達的進一步減少，呈節段性斑片狀分布，電鏡顯示模型組大鼠足細胞的足突病變進一步加重，足細胞失去代償能力，同時出現了足細胞與基底膜的分離、脫落，腎小球基底膜的降解，模型組大鼠的蛋白尿逐漸減少。依次推斷ILK的表達變化與足細胞的損傷密不可分，與蛋白尿的產生息息相關，但足細胞凋亡此實驗未觀察到，什么時候啟動腎小球硬化，是否只有ILK參與啟動腎小球硬化尚未明確。通過次實驗，證實了ILK與阿霉素腎病蛋白尿的產生之間具有一定的相關性，它可能直接或間接地影響了足細胞的功能狀態，引起濾過屏障受損，導致蛋白尿，但其作用方式和具體途徑還有待進一步研究。

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Expression of Integrin-Linked Kinase in Rat Model of Adriamycin Nephrosis*

HE De-gang1*, YANG Xiao-ping2
(1 Department of Internal Medicine, the Frist Affilicated Hospital of Xinglin Hospital Branch of Medical College of Xiamen University, Xiamen 361000, China; 2 Department of Nephrology, the Frist Affilicated Hospital of Shihezi University School of Medicine, Shihezi 832008, China)

ObjectiveTo dynamically observe the expression of ILK in rat model of adriamycin nephrosis, and to explore the possible relation between it and renal glomerular disease.MethodsThe model of adriamycin nephrosis was established by injection with adriamycin via tail-vein for one time, the kidney tissues at different time rats were studied using electronic microscope and immunofluorescence.Results①Compared with the control group, during the first four weeks, 24 h urine protein excretion in the model group was gradually elevated during the frist 7 days and reached its peak on the 21st day (P<0.01). During the later eight weeks, 24 h urine protein of rats in the model group gradually decreased and reached a minimum value during on the 84th day. ②Compared with the control group, during the first four weeks, the expression of ILK was significantly down-regulated with the progression of proteinuria, and elevated and reached its peak during the frist 14 days (P<0.05). After eight weeks, the expression of ILK decreased gradually(P<0.05). ③During the first four weeks,the foot process fusion was seen on the seventh and fourteenth days with electronic microscope. After eight weeks, podocyte lesion of rats in model group further aggravating, appeared to be separated from podocyte and basement membrane. ④The expression of ILK was positively correlated wiIh the amount of 24 h urinary protein(r=0.897, P<0.01).Conclusions①ILK presents early over-expression and abnormal distribution, possibly suggesting a cause of proteinuria occurrence and an important early indicator for acute podocyte injury. ②ILK was positively associated with proteinuria and its renal tissue expression has a certain significance for the judgment on and kidney disease prognosis.

Adriamycin; Proteinuria; ILK

R692

B

1671-8194（2014）34-0005-03

石河子大學聯合基金項目（編號：LHJJ2010B09）

*通訊作者：E-mail： hedegang@126.com