血管緊張素轉化酶結構與功能的生物信息學分析

謝曉明邱芝青謝麗明雷 桅*

（1 廣東醫學院附屬醫院心血管內科，廣東 湛江 524001；2 廣東醫學院附屬醫院藥劑科，廣東 湛江 524001）

血管緊張素轉化酶結構與功能的生物信息學分析

謝曉明1邱芝青2謝麗明2雷 桅1*

（1 廣東醫學院附屬醫院心血管內科，廣東 湛江 524001；2 廣東醫學院附屬醫院藥劑科，廣東 湛江 524001）

目的血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE，EC 3.4.15.1）是人類血壓控制系統的關鍵酶，其抑制劑也是廣泛應用于臨床的降壓和心力衰竭治療一線藥物。方法本文采用Protparam等生物信息學方法和工具對ACE基因及其編碼蛋白的序列特征、分子結構和理化性質等進行了預測分析。結果表明該基因的核苷酸序列全長2473 bp，包括3'-UTR、ORF和5'-UTR序列，其蛋白分子式C3752H5724N1020O1086S26，含732個氨基酸殘基，以Leu含量最高，定位于分泌途徑，含跨膜結構域，是一種含有21個堿基的質體轉運肽和Glu Zincin功能域的疏水性不穩定蛋白質。其二級結構和三維模型解析完成，結果顯示以隨機卷曲和α-螺旋為主。結論本研究可為深入開展人ACE蛋白的酶學特性和血流動力學調節機制研究提供理論參考。

血管緊張素轉化酶；生物信息學；核酸；蛋白

血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE，EC 3.4.15.1）是一種哺乳動物組織中普遍存在的Zn2+依賴型羧二肽酶，為細胞膜上的整合單鏈糖蛋白，催化水解十肽血管緊張素Ⅰ羧基末端兩個氨基酸，生成具有血管收縮作用的八肽血管緊張素Ⅱ或水解具有血管收縮功能的緩激肽生成苯苯-精二肽，是高血壓、心肌梗死、心力衰竭等治療藥物篩選中的關鍵酶[1]。ACE在血壓調節機制中發揮重要作用，通過腎素-血管緊張素系統RAS（rennin-angiotensin system）和激肽釋放酶-激肽系統，對血壓、電解質和體液平衡，以及心血管發育和結構重塑等起關鍵調節功能，而且其抑制劑已經作為高血壓的一線治療藥物成功應用于臨床，如Captoril、Enalapril、Lisinopril等[2-4]。

ACE基因多態性被認為與高血壓、心室肥厚、心肌梗死、糖尿病腎病等有顯著相關性，是多種心血管疾病的易感風險因子。該基因的多態性涉及3’端16號內含子中287 bp位Alu重復序列的插入/缺失（I/D），與循環系統中的血漿ACE濃度相關，DD基因型的ACE酶活是II基因型的2倍，因此ACE基因型ID/DD與心血管疾病的發生發展存在密切聯系[5,6]。本研究擬對人ACE基因及其相應編碼蛋白的序列結構、理化性質、系統進化關系和生化功能特征等進行生物信息學預測和分析，以期在生物化學和分子生物學水平上進一步研究人ACE蛋白的酶學特性和血壓調控機制研究提供理論依據。見圖1。

圖1 血管緊張素轉化酶及其抑制劑在RAS系統中的作用[7]

1 材料與方法

數據來源于NCBI核苷酸和蛋白質數據庫（GenBank）中已登錄的人ACE基因核苷酸序列及其對應的氨基酸序列：ACE（Accession：M26657）。

利用Protparam、Vector NTI Suit 8、MEGA4.1、SignalP等軟件和www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.org等網站所提供的在線分析工具進行預測和分析。核苷酸及氨基酸序列的分子結構和理化性質分析使用Protparam完成；ACE編碼核苷酸序列的開放閱讀框（ORF）搜尋、翻譯和同源性比對使用Vector NTI Suit 8軟件；基于ACE及其他物種的ACE氨基酸序列和MEGA4.1工具，使用Neighbor-Joining（NJ）方法構建ACE蛋白的分子系統進化樹；通過TargetP 1.1 Server在線工具完成ACE蛋白的亞細胞定位，并對其結果進行SignalP及ChloroP分析后得到ACE蛋白信號肽的相關信息；ACE蛋白的跨膜結構域和疏水性分析分別使用TMHMM和ProtScale完成；ACE蛋白的功能結構域和coiledcoil區分別用CDD和COLS分析；ACE蛋白的二級和三級結構預測與建模分別在GOR和SWISS-MODEL系統上計算獲得。

2 結果與分析

2.1 人ACE基因的核苷酸及相應氨基酸序列的分子結構和理化性質分析。來自NCBI的人ACE核苷酸序列全長2473 bp，包括ORF（Open Reading Frame，開放閱讀框）、3'-UTR（Untranslated Regions，非翻譯區）和5'-UTR序列，其中ORF長2196 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。基于Protparam分析所得的ACE編碼蛋白的理化性質[8]，該蛋白分子C3752H5724N1020O1086S26，相對分子質量為83.3304 kDa，摩爾消光系數為156230，理論等電點pI＝6.13，脂肪系數81.19，半衰期為30 h，親水性平均系數（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.380，推測該蛋白表現疏水性，不穩定系數為40.85，即屬不穩定蛋白。人ACE編碼蛋白所含的氨基酸殘基數為732，其組成見表1，可知含Leu最多，且不含Pyl和Sec、Asx、Glx和Xaa。

表1 人ACE蛋白的氨基酸分布

2.2 人ACE蛋白的跨膜結構域與亞細胞定位分析。利用TMHMM Server v. 2.0系統對人ACE蛋白的氨基酸序列進行跨膜結構域預測[9]，結果見圖2，人ACE存在1個跨膜結構域，并且整條肽鏈橫跨于膜內外，位于A682-A702。可見人ACE蛋白的催化功能不是在細胞質基質中進行，而是錨定于質體，后經過蛋白轉運，將血管緊張素Ⅰ送至特定部位，完成血管緊張素Ⅱ的生物合成和血管壓力的活性調節。

用TargetP 1.1 Server在線工具分析[10]顯示，人ACE蛋白定位于分泌途徑，屬分泌型蛋白。該蛋白含有21個氨基酸的轉運肽，預測可靠性等級為1。進一步采用SignalP 3.0 Sever解析人ACE蛋白的氨基酸序列中信號肽區段及其所在位置[11]，發現其N端有21個氨基酸的信號肽，剪切位點在21～22（分值為0.816）（圖3）。

圖2 人ACE蛋白的跨膜結構域預測

圖3 人ACE蛋白的信號肽預測

2.3 人ACE蛋白的保守功能域和coiled-coil結構分析。蛋白質由多個基序組成，且基序相應的氨基酸區段行使特異的生化功能，同時也蘊含著各自的遺傳進化信息。利用CDD在線工具[12]分析人ACE氨基酸序列的功能結構域，即去掉信號肽，剩下的成熟肽氨基酸序列包含一個Glu Zincin功能域（圖4）。表明人ACE編碼蛋白屬于Zn2+依賴酶超家族，而該基序則主要負責催化血管血壓調節過程中關鍵步驟——血管緊張素Ⅱ的生成。

圖4 人ACE蛋白的保守結構域分析

2.4 人ACE蛋白二、三級結構預測與分析。基于GOR4在線工具[13]預測人ACE氨基酸序列的二級結構，結果見圖5。在人ACE多肽鏈中，隨機卷曲占43.58%，α-螺旋占44.40%，延伸鏈占12.02%，可見隨機卷曲和α-螺旋是ACE多肽鏈中的主要結構元件，延伸鏈散布于整個蛋白質中。基于同源性的三維建模，將這條人ACE氨基酸序列上傳至SWISS-MODEL服務器中進行自動化模型生成，然后在ViewerLite 5.0軟件中進行結構編輯[14,15]，獲得ACE的三級結構模型（圖6）。

3 小 結

RAS系統在心腦血管系統的重要作用日益受到重視，其ACE的抑制劑也一直作為高血壓和心力衰竭治療的一線藥物。隨著人類對ACE結構和作用機制的深入研究，可能會產生新的更安全有效，且副作用更少和適應性更強的ACE抑制劑。生物信息學是基于生物醫學臨床和實驗數據，并與先進計算技術和工具相結合的重要方法，已成為現代

圖5 人ACE基因編碼蛋白的二級結構預測

圖6 人ACE基因編碼蛋白的三維結構預測

醫學研究的前沿領域。本文應用生物信息學方法對人ACE基因的核苷酸及其編碼蛋白質序列進行了分析和建模，進而對其分子結構和生化性質進行了預測鑒定，結果表明人的ACE酶定位于分泌途徑，存在跨膜結構域，是一種含有21個堿基的質體轉運肽和Glu Zincin功能域的不穩定疏水性蛋白質，二級和三級結構解析完成，以隨機卷曲和α-螺旋組分為主。本研究結果可為深入開展人ACE蛋白的酶學特性和血壓控制的分子機制研究提供重要理論參考，必將推動ACE抑制劑及其候選藥物的研究開發和心血管醫學的基因治療。

[1] El-Sayedel SM,Abd-Ellah MF,Attia SM.Protective effect of captopril against Cisplatin-induced nephrotoxicity in rats [J].Pak J Pharm Sci,2008,21(3):255-261.

[2] Paul M,Poyan Mehr A,Kreutz R.Physiology of local reninangiotensin system[J].Physiol Rev,2006,86(3):747-803.

[3] Skidgel RA,Alhenc-Gelas F,Campbell WB.Relation of cardiovascular signaling by kinins and products of similar converning enzyme systems; prologue: kinins and related systems New life for old discoveries [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,284(6):1886-1891.

[4] Vaidyanathan S,Jarugula V,Dieterich HA,et al.Clinical pharmacokinetics and pharmaco dynamics of aliskren [J].Clin Pharmacokinet,2008,47(8):515-531.

[5] Morshed M,Khan H,Akhteruzzaman S.Association between Angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism and hypertension in selected individuals of the Bangladeshi population [J].J Biochem Mol Biol,2002,35(3):25-254.

[6] Agachan B,Isbir T,Yilmaz H,et al.Angiotensin converting enzyme I/D,Angiotensinogen T174M-M235T and angiotensin II type 1 receptor A1166C gene polymorphisms in Turkish hypertensive patients [J].Exp Mol Med,2003,35(6):545-549.

[7] 趙鈺嵐,許傳蓮.血管緊張素轉換酶的結構功能及相關抑制劑[J].生物工程學報,2008,24(2):171-176.

[8] Gasteiger E,Hoogland C,Gattiker A,et al.Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M.Walker (ed):The Proteomics Protocols Handbook [M].Humana Press, 2005: 571-607.

[9] Ikeda M,Arai M,Lao DM.Transmembrane Topology Prediction Methods:A Reassessment and Improvement by a consensus method using a dataser of experimentally charaterized transmembrance topologies [J].In Silico Biol,2002,2(1):19-33.

[10] Emanuelsson O,Brunak S,von Heijne G,et al.Locating proteins in the cell using TargetP,SignalP and related tools [J].Nat Protoc ,2007,2(4):953-971.

[11] Petersen TN,Brunak S,von Heijne G,et al.SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions [J]. Nat Methods,2011,8(10):785-786.

[12] Marchler-Bauer A,Bryant SH.CD-Search: protein domain annotations on the fly [J].Nucleic Acids Res,2004,32(Web Server issue):327-331.

[13] Combet C,Blanchet C,Geourjon C,et al.NPS@: Network Protein Sequence Analysis [J].Trends Biochem Sci,2000,25(3):147-150.

[14] Arnold K,Bordoli L,Kopp J,et al. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling [J].Bioinformatics,2006,22(2):195-201.

[15] Kiefer F,Arnold K,Künzli M,et al.The SWISS-MODEL Repository and associated resources [J].Nucleic Acids Res,2009,37(Database issue):D387-D392.

Bioinformatics Analysis of Angiotensin Converting Enzyme （ACE) Structure and Function of Human

XIE Xiao-ming1, QIU Zhi-qing2, XIE Li-ming2, LEI Wei1*
(1 Department of Vasculocardiology, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524000, China; 2 Department of Pharmacy, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524000, China)

ObjectiveAngiotensin converting enzyme (ACE, EC 3.4.15.1) is the key enzyme in human blood press control system, and its inhibitor has been used widely as the clinic first-line drug of antihypertensive and heart-failure treatment.MethodThe sequence characteristics, molecular structure and physicochemical properties of ACE gene and its coding protein were predicted and analyzed by bioinformatic methods and tools like Protparam.ResultsThe length of nucleotide acid sequence was 2473 bp, including 3'-UTR, ORF and 5'-UTR; the molecular formula of the ACE protein was C3752H5724N1020O1086S26 containing 732 aa, and Leu was the most abundant amino acid; ACE was anchored in the secretory pathway, with transmembrane domain, it was an unstable protein with a 21 aa plastidial transit-peptide. At last, its secondary and 3-D modelling was successfully established and it contained mainly alpha helix and random coil.ConclusionThis study can provide the theory references for the enzymatic properties and hemodynamics regulation mechanism of human ACE protein.

Angiotensin converting enzyme; Bioinformatics; Nucleic acid; Protein

R972.4

B

1671-8194（2014）34-0003-03

國家自然科學基金（編號：81300035）；廣東省自然科學基金（編號：S2013040012115）

*通訊作者：E-mail： thdmast@gmail.com