鰭足類線粒體基因的選擇壓力比較及進化關系探討

申欣，田美，孟學平，程漢良，閻斌倫

（1.淮海工學院海洋學院江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇連云港 222005；2.中國科學院北京生命科學研究院，北京 100101）

鰭足類線粒體基因的選擇壓力比較及進化關系探討

申欣1，2，田美1，孟學平1，程漢良1，閻斌倫1

（1.淮海工學院海洋學院江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇連云港 222005；2.中國科學院北京生命科學研究院，北京 100101）

鰭足類Pinnipeds是海洋哺乳動物的重要類群，現存種類包括海象科Odobenidae、海獅科Otariidae和海豹科Phocidae的所有物種。在海豹屬Phoca中，atp8基因的Ka／Ks最高，僅為0.084 7（遠小于1），因而海豹屬所有線粒體蛋白質編碼基因的選擇壓力均非常高。對于群海豹屬Pusa，cox1、cox2和nad3基因的Ka／Ks均為0，表明在這3個基因中，所有的核苷酸的替換均為同義替換，沒有出現氨基酸的改變。科內、屬內基因變異位點的分析表明，nad5、nad4和nad2基因可以作為cox1和cob基因輔助的分子標記。線粒體基因組的系統發育結果，強烈支持食肉目所有12個科均為單系群，并且鰭足類（海獅科、海象科和海豹科）為食肉目Carnivora內部的一個單系群（BPM＝100，BPP＝100）。在鰭足類內部，海獅科與海象科親緣關系最近，聚類為海獅總科Otarioidea，然后與海豹科聚類：（海獅科＋海象科）＋海豹科。在海豹科內部，線粒體基因組的證據支持將海豹科劃分為2個亞科，即僧海豹亞科Monachinae和海豹亞科Phocinae。線粒體基因組的證據，強烈支持鼬科Mustelidae與浣熊科Procyonidae關系最近，臭鼬科Mephitidae與熊貓科Ailuridae近緣，同時，鰭足類與［（鼬科＋浣熊科）＋（臭鼬科＋熊貓科）］為姊妹群，而與熊科Ursidae較遠。犬科Canidae在犬型亞目Caniformia中分化較早，位于犬型亞目的基部。

海獅科；海豹科；海象科；鰭足類；系統發育；線粒體基因組

1 引言

鰭足類Pinnipeds是海洋哺乳動物的重要類群，現存種類包括海象科Odobenidae、海獅科Otariidae和海豹科Phocidae的所有物種［1—2］。鰭足類身體呈紡錘或流線形，四肢被肥厚的蹼膜連成鰭狀。鰭足類的毛皮和肉都具有很高的價值，從而遭受了人類幾個世紀的狂捕濫殺，導致不少種類自然種群的數量不斷減少甚至滅絕。以加勒比僧海豹Monachus tropicalis為例，數量最多時曾超過25萬只，然而由于人類的大量獵殺和棲息地的破壞，最后一次的野外紀錄是在1952年，目前已經完全滅絕，與此同時，還有些鰭足類物種處于滅絕的邊緣［3—4］。因此，對鰭足類自然種群的保護及其遺傳背景的認識刻不容緩。通常認為鰭足類動物起源于一類（或多類）陸生食肉目動物，在約2 000萬年前逐漸進入并適應海洋生活，從而開始了由陸地環境到海洋環境的進化歷程［5］。事實上，鰭足類本身是否為單一起源（單系群）一直存在激烈爭議，另外，鰭足類現存的3個科與陸生食肉目現存類群之間的關系仍然具有諸多分歧［6—7］。后生動物的基因組除了核基因組外，還包括線粒體基因組。線粒體基因組具有基因排列緊湊、成本較低及易于完成等優點，目前被廣泛應用到后生動物分子系統進化、群體遺傳及生物地理的研究［7—11］。本文全面的分析比較現有的24個鰭足類物種線粒體基因組，系統分析鰭足類線粒體基因組的選擇壓力和分子標記；同時，結合陸生食肉目9個科的線粒體基因組，全面、系統地分析了鰭足目的起源及其內部的進化關系。

2 材料和方法

2.1 鰭足類線粒體基因組

目前共有24個鰭足類線粒體基因組，分別為海象科Odobenidae的唯一現存種：海象Odobenus rosmarus rosmarus，海獅科Otariidae的紐西蘭海狗Arctocephalus forsteri、南非海狗Arctocephalus pusillus、瓜達盧佩海狗Arctocephalus townsendi、北海狗Callorhinus ursinus、北海獅Eumetopias jubatus、澳洲海獅Neophoca cinerea、新西蘭海獅Phocarctos hoo犽eri、加州海獅Zalophus californianus，以及海豹科Phocidae的冠海豹Cystophora cristata、髯海豹Erignathus barbatus、灰海豹Halichoerus grypus、豹斑海豹Hydrurga leptonyx、威德爾氏海豹Leptonychotes weddellii、食蟹海豹Lobodon carcinophaga、南象海豹Mirounga leonina、夏威夷僧海豹Monachus schauinslandi、環海豹Phoca fasciata、琴海豹Phoca groenlandica、斑海豹Phoca largha、港海豹Phoca vitulina、里海海豹Pusa caspica、環斑海豹Pusa hispida和貝加爾海豹Pusa sibirica［12—16］。

2.2 線粒體基因組選擇壓力分析

在檢測鰭足類線粒體基因組的選擇壓力時，以海獅科3個南非海狗屬物種（紐西蘭海狗、南非海狗與瓜達盧佩海狗）、海豹科4個海豹屬物種（環海豹、琴海豹、斑海豹與港海豹）以及3個群海豹屬物種（里海海豹、環斑海豹與貝加爾海豹）為數據群。然后，分別借助于Clustal X 2.1軟件［17］，對線粒體13個蛋白質編碼基因（atp6、atp8、cox1-3、cob、nad1-4、nad4L、nad5和nad6）進行多重序列比對（默認參數）。同義替換率（Ks）和非同義替換率（Ka）的計算則是通過DnaSP 5.10.1軟件［18］完成。

2.3 基因差異性分析

以8種海獅科與15種海豹科物種線粒體基因組分別作為數據群，統計了2個科內部的基因變異位點，同時，以3個南非海狗屬物種、4個海豹屬物種和3個群海豹屬物種分別作為數據群，統計了3個屬內的基因變異位點。借助于Clustal X 2.1軟件［17］對15個主編碼基因分別進行多重序列比對。隨后，線粒體單基因的變異位點，則是通過DnaSP 5.10.1軟件［18］來完成。

2.4 進化關系分析

除了24個鰭足類線粒體基因組外，17個陸生食肉目的線粒體基因組（小熊貓Ailurus fulgens、川西小熊貓Ailurus fulgens styani、灰狼Canis lupus、豹Cuon alpinus、臭鼬Mephitis mephitis、東部斑臭鼬Spilogale putorius、海獺Enhydra lutris、水獺Lutra lutra、南美浣熊Nasua nasua、北美浣熊Procyon lotor、大熊貓Ailuropoda melanoleuca、北極熊Ursus maritimus、獵豹Acinonyx jubatus、華南虎Panthera tigris amoyensis、紅頰獴Herpestes javanicus、鬣狗Crocuta crocuta和縞鬣狗Hyaena hyaena）也加入到系統發育分析中。首先提取41個物種（共代表食肉目12個科）的13個蛋白質編碼基因的核苷酸序列，然后首尾相連，進而通過Clustal X 2.1軟件［17］做多重序列比對。對于多重序列比對結果，借助于j Model Test 2.1.3軟件［19］進行替換模型的計算比較，當最適替換模型（GTR＋I＋V）確定后，分別采取最大似然法與貝葉斯法進行系統發育關系重建，使用的軟件分別為Phy ML 3.0［20］和MrBayes 3.2［21］。在最大似然樹構建時，使用自展值檢驗法（Bootstrap＝1 000），來評估系統發育樹中每個分支的可靠性。在貝葉斯分析中，運算1 000 000代，以保證足夠的時間達到收斂。

3 結果和討論

3.1 鰭足類線粒體基因組的主要特征

海獅科8個物種線粒體基因組長度相差較大，介于15 413 bp（紐西蘭海狗）和16 736 bp（澳洲海獅）之間，差距達到2 323 bp。與此相比，海豹科15個物種線粒體基因組的長度較為保守，琴海豹的線粒體基因組最短（16 551 bp），南象海豹的線粒體基因組最長（16 970 bp）。海象線粒體基因組的長度與此相當（16 565 bp）（表1）。

現有鰭足類線粒體基因組的基因組成和基因排列非常保守，均共享脊椎動物典型的基因排列。8種海獅線粒體主編碼鏈的A＋T含量相差較少，介于58.75%（新西蘭海獅）和59.69%（北海狗）之間。與此相比，海豹科線粒體基因組A＋T含量差異較大，貝加爾海豹的A＋T含量最低（58.12%），南象海豹的A＋T含量最高（60.76%）。海象線粒體基因組主編碼鏈的A＋T含量為59.41%（表1）。

表1 鰭足類線粒體基因組的基本特征

3.2 鰭足類線粒體基因的選擇壓力分析

在南非海狗屬中，cox1基因的Ka／Ks最低，為0.007 7，其次為cox2、nad6和nad3基因（分別為0.014 1、0.015 1和0.019 0），說明在南非海狗線粒體基因組中，這些基因的選擇壓力較高；而atp8基因的Ka／Ks最高，為0.181 6，其次為nad2、nad5和nad4基因（分別為0.087 2、0.085 7和0.058 6），從而說明它們的選擇壓力較小。對于海豹屬，cox1基因的Ka／Ks最低，為0.005 5，其次為nad3、cox2和nad4L基因（分別為0.006 5、0.017 4和0.018 5）；而atp8基因的Ka／Ks最高，僅為0.084 7，因此海豹屬線粒體基因組中，所有蛋白質編碼基因的選擇壓力均非常高。在群海豹屬，cox1、cox2和nad3基因的Ka／Ks均為0，說明在這3個基因中，所有核苷酸的替換均為同義替換，沒有出現氨基酸的改變；而nad4L基因的Ka／Ks最高，為0.2603，其次為atp6、atp8和nad2基因（分別為0.110 9、0.085 9和0.071 6），從而說明這些基因的選擇壓力較小（圖1）。

圖1 南非海狗屬、海豹屬和群海豹屬線粒體基因選擇壓力分析

3.3 鰭足類線粒體基因的分子標記分析

南非海狗屬內部線粒體基因的變異位點結果表明，nad5基因的變異位點數最多（222個），其次為nad4、cox1、cob和nad2基因，變異位點的數目分別為148、147、127和125個。海豹屬和群海豹屬線粒體變異位點數的分析結果與南非海狗屬類似，nad5、nad4、cox1、cob和nad2基因的變異位點數位于前列。在海獅科線粒體基因組中，nad5基因的變異位點數最多（524個），其次為nad4、cox1、cob和nad2基因，變異位點的數目分別為384、347、274和265個。在海豹科15個線粒體基因組單基因的變異位點分析中，nad5基因的變異位點數最多（635個），其次為nad4、cox1、cob和nad2基因，變異位點的數目分別為475、469、360和351個。綜合屬內與科內基因變異位點的分析結果，均支持nad5、nad4和nad2基因作為cox1 和cob基因輔助的分子標記，為鰭足類群體遺傳及分子生態的研究提供有價值的遺傳信息。

3.4 進化關系分析

與其他食肉目動物相比，鰭足類在形態和生活方式上差異巨大，鰭足類動物到底作為一個目與食肉目并列，還是作為食肉目下的一個類群，長期以來一直存在爭議［22—24］。目前數據庫中共有24個鰭足類線粒體基因組全序列；除了鰭足類線粒體基因組外，17個陸生食肉目的線粒體基因組也包含在系統發育分析中（共41個線粒體基因組，代表12個科），以利于從線粒體基因組層次全面系統的了解食肉目的進化歷史。

以線粒體所有蛋白質編碼基因為數據群，采用2種建樹方法（最大似然法和貝葉斯法），所構建系統發育樹的拓撲結構完全一致。線粒體基因組的數據支持鰭足類作為食肉目內部的一個類群（見圖2）。同時，根據化石的證據來看，最早的鰭足類動物的化石是中新世時期，而哺乳綱其他各目最晚出現在始新世，這也支持鰭足類不能單列為一個目［5］。食肉目下分為2個分支：貓型亞目和犬型亞目（BPM＝100，BPP＝100）。

鰭足類本身是否為單系群，以及鰭足類3個科之間的關系存在較多爭議［6—7，25］。線粒體基因組的系統發育結果，強烈支持食肉目所有12個科均為單系群，并且鰭足類（海獅科、海象科和海豹科）為單系群（BPM＝100，BPP＝100）。在鰭足類內部，海獅科與海象科親緣關系最近，聚類為海獅總科Otarioidea，然后與海豹科聚類：（海獅科＋海象科）＋海豹科（見圖2）。在海豹科內部，線粒體基因組的證據支持將海豹科劃分為2個亞科，即僧海豹亞科和海豹亞科。僧海豹屬Monachus、象海豹屬Mirounga、食蟹海豹屬Lobodon、豹海豹屬Hydrurga和威德爾海豹屬Leptonychotes聚在一支，組成僧海豹亞科（BPM＝100，BPP＝100）。同時，髯海豹屬Erignathus、冠海豹屬Cystophora、海豹屬Phoca、灰海豹屬Halichoerus和群體海豹屬Pusa聚在另外一支，組成海豹亞科（BPM ＝100，BPP＝100）。

除了鰭足類是否為單系群的問題外，鰭足類3個科與陸生食肉目各科之間的親緣關系一直以來存在激烈爭議［7，25］。線粒體基因組的證據，強烈支持鼬科與浣熊科關系最近（BPM＝100，BPP＝100），臭鼬科與熊貓科近緣（BPM＝65，BPP＝100），（鼬科＋浣熊科）與（臭鼬科＋熊貓科）互為姊妹群（BPM＝99，BPP ＝100）。同時，在陸生食肉目中，鰭足類與［（鼬科＋浣熊科）＋（臭鼬科＋熊貓科）］親緣關系最近（BPM＝78，BPP＝100），而與熊科較遠。犬科在犬型亞目中分化較早，位于犬型亞目的基部（見圖2）。

圖2 基于線粒體蛋白質編碼基因構建的進化關系樹

4 結論

現有鰭足類線粒體基因組的基因組成和基因排列非常保守，均共享脊椎動物典型的基因排列。在南非海狗屬中，cox1基因的Ka／Ks最低，其次為cox2、nad6和nad3基因，說明在南非海狗線粒體基因組中，這些基因的選擇壓力較高；而atp8基因的Ka／Ks最高，其次為nad2、nad5和nad4基因，從而說明這些基因存在較小的選擇壓力和功能束縛。對于海豹屬，cox1基因的Ka／Ks最低，其次為nad3、cox2和nad4L基因；而atp8基因的Ka／Ks最高且遠小于1，因此海豹屬線粒體基因組中，所有蛋白質編碼基因的選擇壓力均非常高。在群海豹屬，cox1、cox2和nad3基因的Ka／Ks均為0，說明在這3個基因中，所有核苷酸的替換均為同義替換，沒有出現氨基酸的改變。綜合屬內與科內基因變異位點的分析結果，均支持nad5、nad4和nad2基因作為cox1和cob基因輔助的分子標記。線粒體基因組的系統發育結果，強烈支持鰭足類作為食肉目內部的一個類群。同時，強烈支持食肉目所有12個科均為單系群，并且鰭足類（海獅科、海象科和海豹科）本身為單系群。在鰭足類內部，海獅科與海象科親緣關系最近，聚類為海獅總科，然后與海豹科聚類：（海獅科＋海象科）＋海豹科。在海豹科內部，線粒體基因組的證據支持將海豹科劃分為2個亞科，即僧海豹亞科和海豹亞科。線粒體基因組的證據，強烈支持鼬科與浣熊科關系最近，臭鼬科與熊貓科近緣，同時，鰭足類與［（鼬科＋浣熊科）＋（臭鼬科＋熊貓科）］為姊妹群，而與熊科較遠。

［1］ Reeves R R，Stewart B S，Clapham P J，et al.Guide to marine mammals of the world［M］.New York：Knopf，2002.

［2］ Berta A，Sumich J L，KovacsKM.Marine mammals：evolutionary biology［M］.Boston，London：Elsevier／Academic Press，2006.

［3］ McClenachan L，Cooper A B.Extinction rate，historical population structure and ecological role of the Caribbean monk seal［J］.Proc Biol Sci，2008，275（1641）：1351—1358.

［4］ Debrot A O.A review of records of the extinct west indian monk seal，Monachus tropicalis（carnivora：phocidae），for the netherlands antilles［J］. Marine Mammal Science，2000，16（4）：834—837.

［5］ Rybczynski N，Dawson M R，Tedford R H.A semi-aquatic Arctic mammalian carnivore from the Miocene epoch and origin of Pinnipedia［J］.Nature，2009，458（7241）：1021—1024.

［6］ Delisle I，Strobeck C.A phylogeny of the Caniformia（order Carnivora）based on 12 complete protein-coding mitochondrial genes［J］.Mol Phylog enet Evol，2005，37（1）：192—201.

［7］ Arnason U，Gullberg A，Janke A，et al.Mitogenomic analyses of caniform relationships［J］.Mol Phylogenet Evol，2007，45（3）：863—874.

［8］ Yu L，Peng D，Liu J，et al.On the phylogeny of Mustelidae subfamilies：analysis of seventeen nuclear non-coding loci and mitochondrial complete genomes［J］.BMC Evol Biol，2011，11：92—107.

［9］ Boore J L，Macey J R，Medina M.Sequencing and comparing whole mitochondrial genomes of animals［J］.Methods Enzymol，2005，395：311—348.

［10］ Curole J P，Kocher T D.Mitogenomics：digging deeper with complete mitochondrial genomes［J］.Trends Ecol Evol，1999，14（10）：394—398.

［11］ Boore J L.Animal mitochondrial genomes［J］.Nucleic Acids Res，1999，27（8）：1767—1780.

［12］ Arnason U，Adegoke J A，BodinK，et al.Mammalian mitogenomic relationships and the root of the eutherian tree［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（12）：8151—8156.

［13］ Lin Y H，McLenachan P A，Gore A R，et al.Four new mitochondrial genomes and the increased stability of evolutionary trees of mammals from improved taxon sampling［J］.Mol Biol Evol，2002，19（12）：2060—2070.

［14］ Arnason U，Gullberg A，Janke A，et al.Pinniped phylogeny and a new hypothesis for their origin and dispersal［J］.Mol Phylogenet Evol，2006，41 （2）：345—354.

［15］ Arnason U，Gullberg A.Comparison between the complete mtDNA sequences of the blue and the fin whale，two species that can hybridize in nature［J］.J Mol Evol，1993，37（4）：312—322.

［16］ Arnason U，Johnsson E.The complete mitochondrial DNA sequence of the harbor seal，Phoca vitulina［J］.J Mol Evol，1992，34（6）：493—505.

［17］ Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al.Clustal W and Clustal X version 2.0［J］.Bioinformatics，2007，23（21）：2947—2948.

［18］ Rozas J，Sanchez-DelBarrio J C，Messeguer X，et al.DnaSP，DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods［J］.Bioinformatics，2003，19（18）：2496—2497.

［19］ Darriba D，Taboada G L，Doallo R，et al.j Model Test 2：more models，new heuristics and parallel computing［J］.Nat Methods，2012，9（8）：772.

［20］ Guindon S，Dufayard J F，Lefort V，et al.New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies：assessing the performance of Phy ML 3.0［J］.Syst Biol，2010，59（3）：307—321.

［21］ Ronquist F，Teslenko M，van der Mark P，et al.MrBayes 3.2：efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space ［J］.Syst Biol，2012，61（3）：539—542.

［22］ Yonezawa T，Kohno N，Hasegawa M.The monophyletic origin of sea lions and fur seals（Carnivora；Otariidae）in the Southern Hemisphere［J］. Gene，2009，441（1／2）：89—99.

［23］ Higdon JW，Bininda-Emonds O R，Beck R M，et al.Phylogeny and divergence of the pinnipeds（Carnivora：Mammalia）assessed using a multigene dataset［J］.BMC Evol Biol，2007，7：216—234.

［24］ Flynn JJ，Finarelli J A，Zehr S，et al.Molecular phylogeny of the carnivora（mammalia）：assessing the impact of increased sampling on resolving enigmatic relationships［J］.Syst Biol，2005，54（2）：317—337.

［25］ Yu L，Luan P T，Jin W，et al.Phylogenetic utility of nuclear introns in interfamilial relationships of Caniformia（order Carnivora）［J］.Syst Biol，2011，60（2）：175—187.

Selection pressure comparison and evolutionary relationships exploration of pinnipeds mitochondrial genes

Shen Xin1，2，Tian Mei1，Meng Xueping1，Cheng Hanliang1，Yan Binlun1
（1．JiangsuKey Laboratory of Marine Biotechnology，College of Marine Science，HuaihaiInstitute of Technology，Lianyungang 222005，China；2．BeijingInstitutes of Life Science，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）

Current pinnipeds is one important group of marine mammals，which including all species in three families （Odobenidae，Otariidae and Phocidae）.In the genus Phoca，theKa／Ks rate of atp8 gene is highest and only 0.084 7（much less than 1），so all Phoca mitochondrial protein-coding genes bear very high selection pressure.In Pusa，Ka／Ks rates of three genes（cox1，cox2 and nad3）are equal to 0，indicating that replacement of all nucleotides in these three genes are synonymous substitutions and none amino acid change.Analyses of genetic variations within family and genus indicted that nad5，nad4，and nad2 genes can be used as molecular markers assisted to cox1 and cob gene.Phylogenetic results based on mitochondrial genomes strongly support that all 12 families from Carnivora are monophyletic group，and pinnipeds（Otariidae，Odobenidae and Phocidae）are one monophyletic group within Carnivora（BPM＝100，BPP＝100）.Within the pinnipeds，the relationship between Otariidae and Odobenidae is close（Otarioidea），then cluster with Phocidae：（Otariidae＋Odobenidae）＋Phocidae.Evidences of mitochondrial genomes support that Phocidae are divided into two subfamilies（Monachinae and Phocinae）.Mitochondrial genomic evidence strongly supports close relationship between Mustelidae and Procyonidae.Meanwhile，Mephitidae clustering with Ailuridae is supported powerfully.Pinnipeds as a sister group to［（Mustelidae＋Procyonidae）＋（Mephitidae＋Ailuridae）］，then cluster with the family Ursidae.Canidae is differentiation earliest and is located in base position of the suborder Caniformia.

Otariidae；Phocidae；Odobenidae；Pinnipeds；phylogeny；mitochondrial genome

Q915.874

A

0253-4193（2014）06-0087-07

2013-07-01；

2013-09-02。

國家自然科學基金（40906067）；香江學者計劃（XJ2012056）；中國博士后科學基金（2012M510054，2012T50218）；中央財政支持地方高校發展專項資金（CXTD04）；江蘇省“青藍工程”人才基金資助項目（蘇教師［2010］27號）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。

申欣（1981—），男，山東省成武縣人，副教授，博士，主要從事基因組學和分子系統學研究。E-mail：shenthin＠163.com

申欣，田美，孟學平，等.鰭足類線粒體基因的選擇壓力比較及進化關系探討［J］.海洋學報，2014，36（6）：87—93，

10.3969／j. issn.0253-4193.2014.06.011

Shen Xin，Tian Mei，Meng Xueping，et al.Selection pressure comparison and evolutionary relationships exploration of pinnipeds mitochondrial genes［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（6）：87—93，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.06.011