白術(shù)茯苓湯高中低劑量對脾虛型克羅恩病大鼠血清TNF—α和IL—1、IL—6的影響

鐘強等

【摘要】目的：考察白術(shù)茯苓湯高中低劑量對脾虛型克羅恩病（CD）大鼠促炎因子的影響；初步探討該方治療脾虛CD的最佳有效劑量。方法：采用破氣耗氣加饑飽失常之復因脾虛造模方法結(jié)合Morris方法復制脾虛型CD大鼠動物模型，白術(shù)茯苓湯高中低劑量灌胃給藥，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）含量。結(jié)果：與空白組相比，模型組TNF-α、IL-1、 IL-6升高（P<0.05）；與模型組相比，高劑量組TNF-α、IL-1降低（P<0.05）；中劑量組TNF-α、IL-1、 IL-6降低（P<0.05）；低劑量組TNF-α降低（P<0.05）。結(jié)論：白術(shù)茯苓湯高中低劑量對脾虛型克羅恩病（CD）大鼠促炎因子的影響不同。其中白術(shù)茯苓湯中劑量組對TNF-α、IL-1、 IL-6的調(diào)節(jié)作用全面且優(yōu)于高劑量組和低劑量組。

【關(guān)鍵詞】白術(shù)茯苓湯；脾虛型克羅恩病；影響

【中圖分類號】R222 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）04-0223-01

克羅恩病（Crohns disease， CD）是一種病因及發(fā)病機制尚未明確的慢性非特異性炎性腸病（IBD），病變主要影響結(jié)腸粘膜，且以潰瘍?yōu)橹鳌Ｄ壳罢J為CD的發(fā)病是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，且與免疫功能異常密切相關(guān)。西醫(yī)治療主要使用水楊酸類、類固醇類和免疫抑制劑等以控制急性發(fā)作，緩解病情，減少并發(fā)癥等，但療效不穩(wěn)定。迄今尚未有任何一種療法被認為是治療CD的特效療法。現(xiàn)今，中醫(yī)辨證論治以及中西醫(yī)結(jié)合治療對其有著較好療效[1]。研究表明CD的病機特點為脾虛夾濕[2]。白術(shù)茯苓湯由白術(shù)、茯苓組成，具有健脾祛濕的功效。是治療脾胃氣虛證、脾虛濕滯證等的經(jīng)典小方和常用藥對[3]。本研究觀察了白術(shù)茯苓湯高中低劑量對脾虛型CD大鼠血清TNF-α、IL-1、 IL-6水平的影響，探索白術(shù)茯苓湯高中低劑量調(diào)控脾虛型CD大鼠細胞因子的藥效相關(guān)性，為中醫(yī)方劑劑量配比理論提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 動物

SPF級SD（Sprague Dawley）大鼠50只，由成都達碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（川）2008-11，雌雄各半，體重200±20g，檢疫后備用。適應性飼養(yǎng)1周，自由攝食顆粒飼料，動物房溫度維持在18-25℃左右。成都中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院SPF級動物實驗室進行，設(shè)施合格證：川實動管使第2003-015號。

1.2 藥材與試劑

白術(shù)、茯苓、大黃、厚樸、枳實均購自同仁堂成都分店，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學制劑室鑒定為正品。

2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）購自Sigma公司，批號：P2297。進口分裝腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）定量試劑盒（LOT：201106）、白介素-1（Interleukin-1，IL-1）定量試劑盒（LOT：201106）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）定量試劑盒（LOT：201106）由成都亞芯科技有限公司提供。

1.3 供試藥物制備

1.3.1 中藥湯劑的制備

稱取藥材，浸泡30min，共煎煮2次，每次30min，合并濾液，60℃恒溫水浴濃縮至1g/ml，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.1 小承氣湯的配比

厚樸：枳實：大黃為3：3：2。

1.3.1.2 白術(shù)茯苓湯的高中低劑量

大鼠用藥劑量按照國家中醫(yī)藥管理局的相關(guān)規(guī)定，人鼠單位體重用藥量直接換算后的5、10、20倍為低、中、高劑量[4]。

1.3.2 TNBS灌腸液的制備

無水乙醇加雙蒸餾水配成50%乙醇75ml，然后將5%TNBS10ml×15與50%乙醇（2：1=V：V）混合均勻，滅菌后裝瓶4℃保存。

1.4 脾虛型CD動物模型制備

本實驗采用破氣耗氣加饑飽失常之復因脾虛造模法[5]結(jié)合Morris方法[6]建立脾虛型CD動物模型。50只SD大鼠，全部雄性，按體重隨機分為2批，10只常規(guī)飼養(yǎng)，為空白組，40只造模。空白組10只，常規(guī)飼養(yǎng)；40只造模大鼠采用小承氣湯按20ml（kg/d），1次/d的劑量灌胃，加隔天禁食造成饑飽失常，連續(xù)14d，復制脾虛模型。并于造模第7d開始禁食不禁水24h，用2%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉，予TNBS灌腸液1ml灌腸。灌腸器插入肛門約6cm-8cm，注入灌腸液1ml。大鼠頭朝下體位，且灌腸器拔出后再繼續(xù)保持1min左右，以防灌腸液流出。每隔5d重復灌腸1次，共5次。

1.5 實驗分組及給藥方法

造模結(jié)束后，造模大鼠隨機分為1個模型組、白術(shù)茯苓湯高、中、低劑量組。空白組從實驗開始至實驗結(jié)束正常喂食、飲水；模型組灌胃等量0.9%生理鹽水，1次/d，連續(xù)7d，白術(shù)茯苓湯高中低劑量組按10ml/kg灌胃，1次/d，連續(xù)5d。

1.6 標本采集與處理

各組實驗大鼠在第38d禁食不禁水24h，股動脈取血處死。取血后不抗凝4℃靜置保存2-3h，用離心機2500r/min離心15min，取上清液為待測樣本。用ELISA法測定血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，組間計量資料比較采用單因素方差分析法，結(jié)果以均數(shù)±標準差（ X±s）表示，

2結(jié)果

2.1 脾虛型CD大鼠一般情況

造模后各組大鼠均出現(xiàn)腹瀉、粘液膿血便、肛周大量糊狀稀便黏附、食量減少、形體消瘦、毛發(fā)干枯、喜靜愛扎堆。白術(shù)茯苓湯高中低劑量組經(jīng)治療后，高、低劑量組大鼠仍有少量稀便、粘液便、肛周糊有少量稀便；中劑量組大鼠大便基本恢復正常，肛周逐漸干凈，體重增加。

2.2 各組大鼠血清細胞因子水平的變化比較（表1）

3 討論

CD在中醫(yī)學中尚無某一病名與之對應，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，常將其歸屬于“泄瀉”、“腸澼”、“腹痛”、“痢疾”、“便血”等范疇。臨床觀察發(fā)現(xiàn)該病基本病機為脾虛夾濕。脾主運化，喜燥惡濕，脾虛氣弱常既發(fā)水濕停滯的病變，若飲食不節(jié)或情志不遂等致脾胃損傷，脾不運濕，水濕停滯，濕濁下注腸道，則發(fā)為泄瀉，正如《素問.藏氣法時論》謂：“脾病者……虛則腹?jié)M，腸鳴饗泄，食不化。”濕滯腸間，搏結(jié)氣血，氣血運行不暢，血肉腐敗，則見腹痛、便血等。脾虛夾濕是CD的基本病機之一，治當健脾祛濕。白術(shù)茯苓湯出自《古今醫(yī)統(tǒng)大全》，為“治濕瀉，又治食積、濕熱作瀉”之基礎(chǔ)方。方中白術(shù)益氣健脾兼能燥濕，茯苓淡滲利濕兼可健脾，二藥相配，相須為用，既加強了益氣健脾以助運化的作用，其燥濕滲濕作用又顧及了脾不運濕、濕濁下注之病變。在方劑學研究中，藥對配伍是方劑配伍的基礎(chǔ)，劑量配比是方劑研究的基礎(chǔ)，因此本研究采用白術(shù)茯苓湯高中低劑量配比的實驗設(shè)計，旨在探索白術(shù)茯苓這一基本藥對的高中低劑量配比對脾虛型CD大鼠治療的藥效相關(guān)性。

西醫(yī)學中CD為慢性肉芽腫性炎癥，病變可累及胃腸道各部位，以回腸末端及其鄰近結(jié)腸為主。其發(fā)生普遍認為與環(huán)境、感染、遺傳以及免疫等多種因素綜合作用所致[7]。TNF-α、IL-1、 IL-6等細胞因子已被公認是介導IBD發(fā)病的促炎因子，在IBD患者的結(jié)腸粘膜中，炎性細胞因子如IL-1β、TNF-α、 IL-6升高。本研究結(jié)果顯示與正常組比較，脾虛型CD模型大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1、 IL-6水平明顯升高（P<0.05），白術(shù)茯苓湯高中低劑量配比各組與模型組大鼠血清TNF-α、IL-1、 IL-6比較，高劑量組TNF-α、IL-1降低（P<0.05）；低劑量組TNF-α降低（P<0.05）；中劑量組TNF-α、IL-1、 IL-6降低（P<0.05）。

本次研究提示脾虛型CD大鼠血清中TNF-α、IL-1、 IL-6水平明顯增高，而白術(shù)茯苓湯高中低劑量配比中，尤以中劑量組下調(diào)TNF-α、IL-1、 IL-6水平最為突出和均衡，提示茯苓白術(shù)湯劑量對脾虛型CD療效的影響為非正比關(guān)系，當茯苓白術(shù)湯劑量逐漸增加至一定水平時，藥物作用達到最佳，繼續(xù)增加藥物劑量，藥物的作用反而會降低，以此印證在臨床藥效關(guān)系中，適當?shù)乃幬飫┝坎艜l(fā)揮最佳的治療作用。

參考文獻

[1] 嚴寧娟. 克羅恩病中西醫(yī)研究進展 [D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2007：31-35.

[2] 李乾構(gòu)，周學文，單兆偉. 中華中醫(yī)藥學會內(nèi)科脾胃病第十四次學術(shù)交流會論文匯編[C].山西，2002：2，3，264-266，270.

[3] 賈波，梁煜.補氣健脾組方規(guī)律的文獻及實驗研究 [J].中國醫(yī)藥學報，2003，8（1）：35-37.

[4] 李儀奎，王欽茂.中藥藥理實驗方法學[M].上海：上海科學技術(shù)出版社，1991：61.

[5] 周永生，樊雅莉，陳小野，等.脾氣虛證動物模型規(guī)范化的初步研究—部分免疫功能方面 [J].實驗動物科學與管理，2003，20（2）：1-5.

[6] Morris GP， Beck PL， Herridge MS， et al. Hapten in-duced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon [J]， Gastroenterology，1989，96：795-803

[7] Hanauer SB. Inflammatory bowel disease： epidemio-logy，pathogenesis，and therapeutic opportunities [J]， Inflamm Bowel Dis，2006（12）：3-9.