利用RNA干擾技術探討STAT3對宮頸癌C33a細胞增殖的影響

王 森 陳荏槐 康海鮮 姚運紅 胡新榮 朱 偉*

（廣東醫學院腫瘤研究所，廣東 東莞 523808）

利用RNA干擾技術探討STAT3對宮頸癌C33a細胞增殖的影響

王 森 陳荏槐 康海鮮 姚運紅 胡新榮 朱 偉*

（廣東醫學院腫瘤研究所，廣東 東莞 523808）

目的為了探討信號轉導與轉錄活化因子3（STAT3）對宮頸癌細胞的作用，我們利用RNAi干擾其表達，檢測其對C33a細胞增殖的影響。方法實驗分組為對照組（即正常C33a細胞組）及干擾組（即RNA干擾STAT3組）。利用新型陽離子脂質體轉染試劑Hilymax導入STAT3 RNA干擾序列，而后檢測STAT3的表達，并利用CCK-8法檢測C33a的細胞增殖水平改變。結果與對照組相比，干擾組STAT3 mRNA下降約75%，顯示成功干擾STAT3的基因表達。與對照組相比，在1、2、3 d，干擾組細胞增殖水平較對照組抑制了約19.1%，31.2%，32.0%。結論本研究成功干擾C33a細胞STAT3的表達，且STAT3沉默可進一步抑制C33a細胞增殖。

STAT3；C33a；RNA干擾

信號傳導與轉錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族是一組可以被不同的細胞因子受體激活的蛋白。STAT3是其最為重要的家族成員之一，已有研究表明，STAT3對腫瘤的發生發展具有重要的促進作用。為了探討STAT3對宮頸癌的作用，我們利用RNAi干擾其表達，檢測其對C33a細胞增殖的影響，以期為將來以STAT3為靶點進行腫瘤的防治研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌C33a細胞為廣東醫學院腫瘤研究所保存。Hilymax轉染試劑購自上海同仁化學。DMEM培養基及胎牛血清購自Gibco公司。STAT3的RNA干擾序列由廣州吉瑪生物技術有限公司合成。實驗中使用的CCK-8試劑盒購買于上海生工生物技術服務有限公司。

1.2 方法

實驗分組為對照組（即正常C33a細胞組）及干擾組（即RNA干擾STAT3組）。利用新型陽離子脂質體轉染試劑Hilymax導入STAT3 RNA干擾序列，而后于48 h檢測STAT3的RNA表達，并利用CCK-8法檢測C33a的細胞增殖水平改變。

轉染步驟：Hilymax/siSTAT3=3/1的比例轉染C33a細胞（STAT3 RNA干擾序列為：5'-AAC AUC UGC CUA GAU CGG CUA dTdT-3'，3'-dTdT GUA GAC GGA UCU AGC CGA U-5'）。Trizol法提取總RNA，并將其反轉錄為cDNA進行熒光定量PCR反應。STAT3的引物序列為：上游引物：TGTGCGTATGGGAACACCTA；下游引物：AGAAGGTCGTCTCCCCCTTA；Realtime PCR反應體系如下：首先加入10 μL 2× SYBR Green Master （ROX），而后加入10 μM引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，最后以ddH2O補足20 μL。

C33a細胞增殖檢驗方法：將收獲的轉染后的各組6孔板細胞以每孔5000細胞的濃度鋪板于96孔板。于1、2、3 d時分別加入CCK8每孔10 μL，1～2 h后采用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。細胞抑制率計算公式為：（對照組實際吸光度值/干擾組實際吸光度值-1）×100%。

2 結 果

采用Hilymax轉染試劑將STAT3的RNA干擾序列轉染宮頸癌C33a細胞，后進行PCR檢測。結果顯示，與對照組相比，在RNA水平，干擾組STAT3 mRNA下降約75%，顯示成功干擾STAT3的基因表達（圖1A）。在細胞的增殖影響方面，CCK-8檢測結果顯示，與對照組相比，在1、2、3 d，干擾組細胞增殖水平較對照組分別抑制了約19.1%，31.2%（P＜0.05），32.0%（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 RNA干擾STAT3的表達及其對C33a細胞增殖的影響

3 討 論

宮頸癌是女性生命健康的最重要殺手之一，全世界宮頸癌病例每年有多于27萬患者死亡[1-3]。宮頸癌發生發展過程中牽涉到一系列的信號分子與通路，其中，信號傳導與轉錄激活因子（STAT）蛋白家族是最重要的一個環節。STAT蛋白含有SH2和SH3結構域，它們可與特定的肽段結合。STAT磷酸化后進入胞核內促進靶基因的轉錄。目前已經克隆了7種STAT基因：STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b，STAT6。其中，STAT3可能是宮頸癌的促癌因子。研究表明，宮頸癌組織中磷酸化STAT3表達增高，這提示了STAT3的促癌功能[4,5]。此外，STAT3也能夠促進很多明確的促癌因子如VEGF，MMP-9等的轉錄表達，進而發揮促瘤功能[6,7]。因此，本實驗初步選擇STAT3作為靶向目標，也為將來的深入研究做一鋪墊。

RNAi技術利用短鏈RNA（siRNA）直接結合靶mRNA后導致其降解，從而敲減基因的表達，研究已證明RNAi技術是觀察基因功能的有效方法。我們利用RNA干擾技術成功干擾了C33a細胞中STAT3的表達，其mRNA表達下降約75%。STAT3被敲減后，干擾組C33a細胞的增殖受到抑制。總之，本研究成功干擾C33a細胞STAT3的表達，且STAT3沉默可進一步抑制C33a細胞增殖。

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R73

B

1671-8194（2014）22-0081-02

國家自然科學基金（81302244）；廣東省自然科學基金博士啟動項目（S2012040006311，S2012040006383）；廣東省衛生廳醫學科研基金（編號：B2013293）；廣東醫學院科研基金項目（B2011004，B2011012）

*通訊作者