骨內應力環境下復合血管內皮生長因子骨髓基質干細胞修復創傷性股骨頭壞死的實驗研究

黃 濤陶 杰周孜輝周 淵宋登新傅燕飛

（1 上海第一人民醫院寶山分院骨科，上海 200940；2 上海第一人民醫院骨科，上海 200080；3 上海第一人民醫院寶山分院放射科，上海 200940）

骨內應力環境下復合血管內皮生長因子骨髓基質干細胞修復創傷性股骨頭壞死的實驗研究

黃 濤1陶 杰2周孜輝2周 淵1宋登新1傅燕飛3

（1 上海第一人民醫院寶山分院骨科，上海 200940；2 上海第一人民醫院骨科，上海 200080；3 上海第一人民醫院寶山分院放射科，上海 200940）

目的探討骨內應力對轉染VEGF基因的骨髓間充質干細胞修復創傷性股骨頭壞死的作用。方法設計制作能骨內加壓的空心螺釘，骨髓間充質干細胞培養并轉染VEGF基因，20只實驗犬通過手術截斷股骨頸方法造模，根據術后不同的處理方法分為四組：A組（單純空心螺釘固定）；B組（空心螺釘加人工骨填塞）；C組（空心螺釘加復合轉染VEGF的骨髓間充質干細胞的人工骨填塞）；D組（空心螺釘加復合轉染VEGF的骨髓間充質干細胞的人工骨填塞，同時加壓）。造模20周后，行大體觀察、X線及組織學、免疫組化及Western blot檢測骨修復效果。結果通過手術方式成功制作出創傷性股骨頭壞死的動物模型；在造模20周后，D組血管計數和VEGF的蛋白含量明顯高于其他三組（P＜0.05）；C組血管計數和VEGF的蛋白含量高于A組和B組，有顯著性差異（P＜0.05），低于D組比較有顯著性差別（P＜0.05）；A組和B組血管計數和VEGF蛋白水平遠低于C組和D組，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組和B組血管計數和VEGF蛋白水平之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。結論骨內加壓能顯著提高轉染VEGF的骨髓間充質干細胞對創傷性股骨頭壞死的再血管化，適當的應力刺激有利于骨組織的修復。

股骨頭壞死；應力；間充質干細胞；血管內皮生長因子；修復

股骨頭缺血性壞死塌陷和骨折不愈合是股骨頸骨折術后兩大并發癥。近年來，隨著內固定技術的改進，骨折不愈合率已明顯降低，但股骨頭缺血性壞死塌陷的發生并沒有根本改觀，這也成為一直困擾創傷骨科界的一大難題。

目前對于股骨頭壞死的早期保髖處理，有髓芯減壓術、轉子間截骨術，帶血管蒂肌蒂骨瓣移植術、多孔鉭棒植入術等多種方法使用，針對的均是已發生股骨頭壞死的病例。而對于股骨頸骨折而言，如何能在早期牢固固定骨折，促進骨組織修復；快速重建股骨頭血供，促進新生骨血管化和加強股骨頭軟骨下支撐等方面取得一個相對好的平衡，從而在治療骨折的同時減少甚至達到避免股骨頭壞死的發生仍是一個有待解決的課題。

Wolff定律指出適當的力學刺激造成骨生長質和量的改變。有研究也發現縱向壓力誘導成骨細胞和成纖維細胞分化成骨[1]，我們思考：能否通過某種設計使在骨折內固定的同時能即時在骨內施加一定的應力，從而促使局部骨的快速修復？結合臨床實際，我們設計了能骨內局部加壓的空心螺釘，結合轉染了血管內皮生長因子（VEGF）基因的骨髓基質干細胞（MSCs）的應用，以期為創傷性股骨頭壞死的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 骨內應力傳導裝置的設計

根據中青年人股骨頸骨折保頭手術常用三枚空心加壓螺釘固定的手術方法，采用兩部分設計能夠骨內加壓的應力傳導裝置。為保證螺釘強度和加壓的同步，我們對普通空心加壓螺釘進行了改制（圖1）。螺釘基本參數：釘長35 mm，外徑6.5 mm，內徑3.5 mm，壁厚0.8 mm，螺紋0.7 mm，牙距0.8 mm，牙數：頭端6。釘尾頭型：十字內凹平頭，外徑10 mm，內徑8 mm。加壓裝置：圓柱螺旋壓縮彈簧。自由行程8 mm，通過彈簧回彈力測試儀測試在壓縮行程5 mm時（平均三次），可提供（8.1±0.053）N的回彈力。當螺釘中孔填滿固態物質后，即可通過彈簧的壓縮對釘頭加壓。裝置訂做廠家：蘇州康力骨科器械有限公司。

圖1

1.2 實驗動物的選擇和分組

選取健康雜種犬20只，雌雄不限，體質量（16.9±2.1）kg，犬齡3～5年，上海交通大學實驗動物中心提供。實驗動物共40只股骨頭，全部納入實驗。將實驗動物股骨頭隨機分為A、B、C、D4組，每組各十只股骨頭。動物造模后，A組動物為造模后定制空心螺釘內固定組，B組動物為造模后，定制空心螺釘結合人工骨修復組，C組為造模后，空心螺釘結合VEGF-165基因轉染的MSCs修復組，D組造模后，骨內加壓、空心螺釘結合VEGF-165基因轉染的MSCs修復組。

1.3 主要儀器和試劑

光學倒置顯微鏡日本Olympus公司；FACS Calibur流式細胞儀美國Becton-Dickinson公司；DMEM細胞培養液、胎牛血清美國GIBCO 公司；pCI –neo-hVEGF-165質粒由本中心實驗室保存；LipofectamineTM 2000轉染試劑盒美國Life Technologies Corporation公司；蛋白抽提試劑盒、SABC三步法試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗體、羊抗兔IgG抗體 美國Abcam公司；專業圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0美國Media Cybernetics公司

1.4 骨髓間充質干細胞培養及目的基因轉染

實驗犬行髂嵴穿刺，抽取骨髓約3 mL，密度梯度離心法分離培養骨髓間充質干細胞（MSCs）至第3代，培養液為含20%胎牛血清DMEM液，流式細胞儀檢測CD29、CD31、CD34、CD105的表達。脂質體法轉染pCI–neo-hVEGF-165基因進入MSCs，設置陽性對照組（pCI-neo空質粒組）與陰性對照組（DMEM培養液組）。轉染試劑為陽離子脂質體LipofectAMINETM2000，具體方法按說明書進行。G418篩選。ELISA法檢測轉染后細胞上清液中VEGF濃度。將陽性克隆分散在96孔板中，依據上清液中VEGF濃度進一步篩選、擴增高表達克隆。消化細胞并將細胞配制成1×108/mL細胞懸液，復合于多孔人工骨上，在培養箱中孵育4 h備用。

1.5 動物模型的建立

參與實驗的動物，采用Swiontkowski等的方法[2]，模擬臨床股骨頸骨折的過程，制作創傷性股骨頭壞死的實驗動物模型。犬俯臥位固定，40mg/kg硫賁妥鈉腹腔注射麻醉。采用髖關節外側入路，切開闊筋膜張肌，顯露臀中肌和臀深部肌群，從間隙進入，切開關節囊，在股骨頭半脫位的情況下，用擺鋸造成股骨頸完全骨折。再重新解剖對位后，股骨頭使用定制空心螺釘沿大粗隆下股外側皮質向股骨頭中心點行內固定，外側皮質擴孔到10 mm，用套筒扳手將定制螺釘擰入，盡量使螺釘尾端深入外側皮質內，以增加穩定性。A組造模后定制空心螺釘內固定，B組造模后，空心螺釘內固定，螺釘孔內克氏針填入人工骨并夯實，C組股骨頭使用定制空心螺釘固定完成后，在螺釘釘孔內用克氏針填入復合有VEGF-165基因轉染的MSCs的人工骨并夯實。D組股骨頭使用定制空心螺釘固定，在螺釘釘孔內用克氏針填入復合有VEGF-165基因轉染的MSCs的人工骨，夯實后在螺釘頭端使用彈簧進行加壓。術畢縫合傷口。所有實驗動物術后24 h內限制活動。常規肌注青霉素G80萬單位以預防感染。

1.6 標本制作和觀察

①實驗動物統一在20周后取材檢測。取材前統一在電壓55 kV、電流10 mAs、距離1 m 的條件下拍攝雙側股骨頭正位片。②標本采集：取出股骨頭，縱向鋸開，一部分裝入凍存管，深低溫冰箱凍存；另一部分10%甲醛固定，5%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液對樣本進行充分脫鈣。③切片組織學檢測：將5%EDTA脫鈣后的標本取出，逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚度為4 μm，蘇木精一伊紅（HE）染色，光鏡觀察。④切片免疫組化血管染色檢測并血管計數：切片厚度4 μm，按SABC三步法試劑盒說明書進行染色。一抗兔抗人CD34多克隆杭體1∶150，二抗生物素化羊抗兔IgG。陽性染色表現為棕黃色，定位于血管內皮細胞胞質。應用專業圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0進行血管計數，每片隨機選取三個視野計數，取平均值。⑤Western blot檢測骨組織中VEGF蛋白表達：4組凍存的股骨頭標本，分別碾磨粉碎后，加入總蛋白提取液，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。將勻漿物在4 ℃，10000 rpm條件下離心5 min，取上清與1×SDS凝膠上樣緩沖液混合，并加入不超過4%體積的β一巰基乙醇（β-mercaptoethenal）一起煮沸5 min。上樣經10% SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，標記方向后1%脫脂奶粉室溫封閉過夜。洗膜后加入兔抗人VEGF多克隆抗體（體積比1∶500）37 ℃下雜交2 h，隨后洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（體積比1∶2000）室溫雜交1 h，最后經顯色反應并曝光于X線膠片上。選擇GAPDH作為內參。應用Image-Pro Plus 6.0對圖像的光密度比照內參條帶光密度進行分析。

1.7 統計學方法

本研究實驗數據采用SPSS18.0統計軟件進行統計學處理，數據用（）表示，差異的顯著性用組間t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，定義P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 術后動物及股骨頭肉眼觀察

全部實驗動物均術后存活，無明顯傷口感染。術后實驗動物精神稍差，活動減少，進食量減少，雙側后肢輕度跛行。1～2周后進食增加，步態轉好，活動增加。2周后大部分傷口縫線自行脫落，傷口愈合。20周取材時，全部20只實驗犬均能正常行走。

20周時，A組10只標本骨折處不同程度愈合，未見骨不連。股骨頭外形基本規整，部分股骨頭失去球形外形，呈扁平，有5只股骨頭可見軟節軟骨部分剝脫，殘留軟骨呈蒼白色。B組標本骨折基本愈合，10只股骨頭外形基本規整呈圓形，有6只股骨頭可見軟節軟骨不同程度剝脫，殘留軟骨呈蒼白色，其中一只股骨頭似可見輕度塌陷征象。C組標本骨折愈合，10只股骨頭外形基本規整呈圓形，顏色稍蒼白，未見明顯軟骨剝脫或表面粗糙。D組標本骨折愈合，10只股骨頭外形基本規整呈圓形，顏色正常，未見明顯軟骨剝脫或表面粗糙。

2.2 X線片觀察

A組10只標本骨折線模糊，內固定物未見松動，有2只股骨頭內可見點片狀密度增高影，5只股骨頭軟骨下可見不同程度小囊樣變，骨質結構紊亂。B組10只標本骨折線模糊，頭頸外形正常，內固定物未見松動，有5只股骨頭軟骨下可見囊狀透光區，骨小梁結構紊亂。C組10只標本骨折線模糊，頭頸外形正常，內固定物未見松動，軟骨下未見囊樣變，1只股骨頭可在軟骨下發現斑點狀疏松。D組10只標本骨折線模糊，頭頸外形正常，內固定物未見松動，軟骨下未見囊樣變或骨小梁結構紊亂。見表1。

說明定制的空心螺釘能牢固固定骨折端，滿足穩定骨折端的技術要求，同時也發現術后不限制實驗犬的活動，并不影響骨的愈合。

表1 各組股骨頭缺血性壞死例數（經影像學檢查）

圖2 造模術后20周X線片（左髖D組、右髖A組）

2.3 HE染色結果

A組標本骨小梁可見部分中斷，髓腔內充滿肥大的脂肪細胞,骨細胞核消失,空骨陷窩明顯增多（圖3）。B組標本骨小梁萎縮、稀疏，骨髓內脂肪細胞大小不均勻。可見骨細胞核固縮、邊聚，有較多空的骨陷窩（圖4）。C組標本骨小梁排列較不規則,骨細胞大部分正常,有較多脂肪細胞,空骨陷窩可見（圖5）。D組標本骨小梁排列規則、整齊，骨細胞清晰，骨髓內脂肪細胞分布均勻，空骨陷窩偶見（圖6）。

從大體標本、X線表現和病理切片我們可以得出結論：通過股骨頸截骨再固定的方法，造成了了創傷性的股骨頭缺血性壞死，說明①本實驗創傷性股骨頭缺血壞死造模成功；②空心螺釘固定能為骨質愈合創造良好條件，但并不能減少股骨頭壞死的發病率；③X線平片對于股骨頭缺血性壞死的診斷敏感性較低、有漏診可能。見表2。

表2 各組股骨頭缺血性壞死例數（經病理學檢查）

圖3 A組標本病理學檢查（×200） 圖4 B組標本病理學檢查（×200）

圖5 C組標本病理學檢查（×200） 圖6 D組標本病理學檢查（×200）

免疫組化染色

A、B組標本骨小梁表面的少數細胞出現VEGF陽性表達，染色較淡且稀疏（圖7、8）；C、D組可見骨小梁表面著色較深，且陽性表達細胞數量多，髓內出現大量陽性褐色顆粒（圖9、10）。

圖7 A組標本免疫組化染色（×200） 圖8 B組標本免疫組化染色（×200）

圖9 C組標本免疫組化染色（×200） 圖10 D組標本免疫組化染色（×200）

2.4 血管計數

通過Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫組化切片進行光密度測量，從而得出各組標本血管計數（表3）。A組血管計數水平最少，B組血管計數較A組多，但無統計學意義（P＞0.05）。D組、C組血管計數較A組、B組明顯增加，且有極顯著差異（P＜0.01），說明轉染VEGF的骨髓基質干細胞確實起到了再生血管，加速骨修復的作用。D組和C組之間的統計學比較，有顯著差異（P＜0.05），證明骨內的微應力直接作用，能夠進一步促進骨髓基質干細胞的成血管功能。

表3 各組血管計數結果（）

表3 各組血管計數結果（）

組別 例數（個） 血管計數（個）A組 10 9.12±1.41 B組 10 11.78±2.55 C組 10 26.22±2.13 D組 10 35.81±2.45

2.5 Western Blot檢測各組VEGF蛋白表達

用Western Blot蛋白印跡法分析各組VEGF蛋白表達的影響。結果顯示：四組股骨頭組織中均檢測出有VEGF蛋白的表達，其中D組表達量最高，較C組有顯著性差別（P＜0.05），較A、B組有極顯著性差別（P＜0.01）。A組表達量少，和B組無統計學差別。C組和A、B組有顯著性差別（P＜0.05）。說明轉染VEGF的骨髓基質干細胞相較與單純內固定而言促進血管的再生和修復，而適當的骨內應力能加速這種修復作用。見表4。

表4 各組股骨頭VEGF蛋白表達

圖11 Western blot檢測各組VEGF蛋白表達

3 討 論

和非創傷性股骨頭缺血性壞死發病機制復雜，學說較多不同，創傷性股骨頭缺血性壞死的發病機制相對清楚。比較一致的觀念認為：股骨頸骨折后造成股骨頭血供的中斷，血液循環障礙是導致股骨頭缺血壞死的根本原因。而在修復過程中，破骨細胞介導的骨質吸收往往超過新骨形成的速度，造成骨密度降低，削弱了股骨頭的承重能力，從而在應力作用下發生塌陷。即創傷性股骨頭壞死是生物學因素與生物力學因素共同作用的結果。其病理生理學基礎在于：①新生血管形成障礙，局部血液供應不足；②骨組織損傷壞死或/和新生骨形成能力低下。

生物力學在創傷性股骨頭壞死方面的研究越來越深入。Wolf定律提示我們，任何骨組織的修復與重建都是和其所承受的載荷密切關聯的。Mannl等[3]發現機械應力刺激可以促進新骨的生成活力。另外縱向載荷產生的壓應力對壞死股骨頭的修復極為重要，它可以驅動軟骨基質礦化和MSCs向成軟骨細胞和成骨細胞方向分化，刺激成骨細胞的功能活性，提高骨密度，有助于骨的改建[4,5]。國內作者發現，股骨頭塌陷與松質骨及軟骨下骨生物力學特性關系密切，軟骨下骨的生物力學強度在股骨頭塌陷時下降較松質骨顯著，是股骨頭塌陷的關鍵因素[6]。因此我們設想，除了體外通過改變自體負重來達到影響股骨頭修復的目的外，可否直接從體內構建一個能進行骨內應力傳導的腔室，這樣可以在治療骨折的同時即對可能發生的股骨頭壞死進行干預？通過對臨床常用的空心加壓螺釘進行適當的改進，結合彈簧的加壓，我們構建了一個簡單但加壓持續可靠的骨內加壓裝置。從實驗的結果看，骨內加壓裝置起到了3個方面的效用：①牢固固定骨折斷端，為良好的骨愈合創造了條件；②可以力點準確的對軟骨下骨進行適當加壓，為軟骨下骨提供了進一步的支撐；③給腔內填塞的MSCs施以一定的縱向壓力，促進了成骨和成血管過程，有利于骨折后股骨頭的再生和修復。

中青年股骨頸骨折患者多由高能量創傷引起，且常伴有多發性損傷，相較老年患者而言，股骨頭壞死及骨不連的發生率較高。股骨頸骨折往往造成股骨頭血管血供的中斷，尤其是在有移位的情況下，這是造成創傷性股骨頭壞死的根本原因 。股骨頸骨折后，骨折近端血供破壞.需依靠骨折遠端的新生血管通過爬行進入股骨頭，使之復活并新生骨，這一修復速度大概需7～8個月才能完成。組織學觀察表明，股骨頸骨折后，有85%發生股骨頭缺血壞死，然后經過再血管化、恢復血供、股骨頭復活[7]。顯然，由于股骨頸骨折后股骨頭組織局部普遍存在血供不足和微循環障礙等問題，因此促進血管再生的治療策略應有助于骨損傷修復。

本實驗選擇了能直接作用于血管內皮細胞促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性的血管內皮生長因子作為細胞因子，將VEGF基因通過分子生物學方法轉染入MSCs中，使其能夠穩定長期的表達，為股骨頭內血管的再生和修復提供良好的保證。由于MSCs強大的分化潛能和增殖能力，使轉染了VEGF基因的MSCs具有了更好的修復能力，本實驗結果也表明：填入復合VEGF基因的骨髓間充質干細胞的股骨頭在造模20周后VEGF的含量和血管的計數均高于單純螺釘內固定組，說明轉染后的間充質干細胞能夠穩定的表達VEGF，促進了血管的新生，從而很好的避免了股骨頭的壞死塌陷。

本次實驗初步證實了通過骨內縱向加壓促進了頭內血管的再生和骨壞死的修復，獲得了滿意的效果。但是不足之處在于：沒有測定釘頭加壓后對股骨頭內壓有何影響？是否會加重骨內高壓反而造成股骨頭缺血性壞死的出現或加重？骨內高壓是由于骨內靜脈回流受阻，靜脈淤滯，組織水腫而造成內壓的增高，組織的壞死。從理論上分析，螺釘釘道內的縱向加壓，壓力方向為釘尾至釘頭，局限于釘孔內，不影響頭內的血運，因而不會加重骨內壓的發生。當然，這還需要進一步的實驗驗證。

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Vascular Endothelial Growth Factor Gene-modified Mesenchymal Stemcells for the Treatment of Traumatic Osteonecrosis of the Femoral Head in Internal Stress Environment of Bone

HUANG Tao1, TAO Jie2, ZHOU Zi-hui2, ZHOU Yuan1, SONG Deng-xin1, FU Yan-fei3
(1 Department of Orthopedic, Baoshan Branch of Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200940, China; 2 Department of Orthopedic, Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080, China; 3 Department of Radiology, Baoshan Branch of Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200940, China)

ObjectiveTo explore the effects of internal stress of bone on vascular endothelial growth factor gene-modified mesenchymal stem cells in repairing traumatic avascular necrosis of the femoral head in canine models.MethodsDesign and makethe hollow screws that can be intraosseous pressure,mesenchymal stem cell culture andVEGF-gene transfected.Animal model was set up by the femoral neck osteotomy.20 dogs were divided into 4 groups: Group A is the femoral neck fixating by hollow screw only; Group B is the femoral neck fixating by hollow screwand artificial bone; Group C is the femoral neck fixating by hollow screwand artificial bone composited VEGF transfected mesenchymal stem cells; Group D is the femoral neck fixating by hollow screwand artificial bone composited VEGF transfected mesenchymal stem cells,meanwhile, compressedscrew.After 20 weeks, repair effect of bone and blood vessel was determined by methods including Immunohistochemical technique, image analysis and Western blotting.ResultThe animal model of traumatic avascular necrosis of the femoral head was successfully produced through the operation.As shown in immunohistochemical techniqueand western blotting, Vessel count and VEGF-protein content, the Group D were significantly higher than the other three groups(P＜0.05), the Group C were higher than the Group Aand the Group B(P＜0.05)but lower than the Group A.There was no significant difference between the group A and the group B(P＞0.05).ConclusionIntraosseous pressure can significantly improve revascularization with the VEGF transfected mesenchymal stem cells on traumatic avascular necrosis of the femoral head.Appropriate stress stimulation to necrotic femoral head can speed up the repair of the bone.

Femoral head necrosis; Stress; Mesenchymal stem cells; Vascular endothelial growth factor; Repair

R68

B

1671-8194（2014）22-0078-04

上海市衛生局科技發展基金項目（編號：2009229）