耐亞胺培南銅綠假單胞菌臨床分離株金屬酶檢測的研究

袁云祥 劉存芬 胡麗香

（云南省安寧市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 安寧 650302）

耐亞胺培南銅綠假單胞菌臨床分離株金屬酶檢測的研究

袁云祥 劉存芬 胡麗香

（云南省安寧市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 安寧 650302）

目的了解云南省安寧地區(qū)臨床分離的銅綠假單胞菌（PA）亞胺培南耐藥株產(chǎn)金屬酶β-內(nèi)酰胺酶的情況。方法以頭胞他啶、亞胺培南，美洛培南為底物，以地酸二鈉（EDTA-Na2）為酶抑制劑，應(yīng)用復(fù)合紙片法檢測159株臨床分離的PA亞胺培南耐藥株β-金屬內(nèi)酰胺酶。結(jié)果159株受試菌株中有35株復(fù)合紙片試驗(yàn)陽性，表示受試菌株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶。結(jié)論產(chǎn)金屬酶是PA對碳青酶烯類抗菌藥物耐藥的機(jī)制之一；實(shí)驗(yàn)室重視對金屬酶的檢測可幫助臨床合理選用抗菌藥物并減少細(xì)菌耐藥性的傳播。

耐亞胺培南銅綠假單胞菌；金屬酶檢測

隨著我國醫(yī)療事業(yè)的快速發(fā)展，臨床對醫(yī)學(xué)理論研究工作給予了足夠的重視，一些新藥物及成分得到了普及推廣，在臨床治療中發(fā)揮了良好的治療效果。β-內(nèi)酰胺酶是醫(yī)藥學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容，其涉及到多個(gè)方面的要素構(gòu)成，而金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-β-lactamase，MBL）是β-內(nèi)酰胺酶的主要構(gòu)成。一般情況下，產(chǎn)酶細(xì)菌是一種較好的耐用藥物，其對青霉素類、頭胞菌素類、碳青酶烯類等具有良好的用藥效果，但是除了單環(huán)β-內(nèi)酰胺類（氨曲南等）之外，這是臨床使用需要注意的內(nèi)容[1，2]。按照藥物學(xué)理論研究成果，銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）能夠得到MBL基因，但要借助質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等作用。本次分析了耐亞胺培南銅綠假單胞菌臨床分離株金屬酶檢測的結(jié)果，具體如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源：來自我院2003年1月至2013年12月臨床送檢標(biāo)本（包括痰、尿、傷口分泌物、血液）中分離的PA亞胺培南耐藥株159株。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 抗生素紙片及培養(yǎng)基：抗菌藥物紙片亞胺培南（IMP）、美洛培南（MEM）、頭胞他啶（CAZ）、MH瓊脂均購自英國Oxoid公司。化學(xué)試劑 EDTA-Na2由美國Sigma公司提供。

1.3 檢測：①菌株鑒定：使用常規(guī)方法或VITEK系統(tǒng)GNI卡（法國Bio-Merieux公司提供）進(jìn)行鑒定。②復(fù)合紙片法檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶：根據(jù)文獻(xiàn)[3]用棉拭子將0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙和坑?塊90 mmMH平板上，在一塊平板上貼上IMP、MEM各2片，紙片相互距30～40 mm，并分別在一片IMP、MEM紙片上各加上10 μL 0.5 mol/L（pH=8.0）EDTA；于另一塊MH平板上貼上兩片CAZ和一片空白濾紙片，在一片CAZ和空白紙片上各加10 μL EDTA，二塊平板35 ℃孵育24 h，觀察結(jié)果。

圖1

圖2

表1 159株P(guān)A亞胺培南耐藥株金屬酶檢測結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 CAZ-EDTA復(fù)合紙片法以抑菌圈增大≥4.0 mm為陽性，IMPEDTA、MEM-EDTA的抑菌圈直徑增大≥7.0 mm為陽性[3]。對照菌株ATCC27853復(fù)合紙片法結(jié)果為陰性。見圖1、圖2。

2.2 159株銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥株金屬酶檢測有7種表型，見表1。

3 討 論

經(jīng)過較長時(shí)間的研究，最終發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌是金屬β-內(nèi)酰胺酶形成的主要來源，其通過多方面的藥物學(xué)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生MBL，并且在特定條件下可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。一般情況，PA對碳青酶烯類抗生素具有的耐藥性，多數(shù)來源于金屬β-內(nèi)酰胺酶，這是實(shí)驗(yàn)室研究公認(rèn)的成果。從結(jié)構(gòu)形式劃分，金屬β-內(nèi)酰胺酶處在B類的范疇，這種要素對MBL的機(jī)制特點(diǎn)產(chǎn)生了明顯的影響。但是，如果從Bush功能展開規(guī)劃，則又可屬于Ⅲ類β-內(nèi)酰胺酶，這是利用半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸等，采用離子間相互結(jié)合的形式，最終生成了相應(yīng)的產(chǎn)物。此次分析發(fā)現(xiàn)，在本研究中，EDTA具有很強(qiáng)的金屬離子特性，對鋅離子結(jié)合之后能減小相應(yīng)的靈活性，從而提升了藥物病理學(xué)機(jī)制的發(fā)揮。由此可以看出，金屬β-內(nèi)酰胺酶是經(jīng)過多種要素變化的產(chǎn)物，臨床借助微生物實(shí)驗(yàn)室檢測產(chǎn)MBL銅綠假單胞菌是十分有效的方法。

根據(jù)此次實(shí)驗(yàn)室結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OprD2通道丟失能夠反映出Pa亞胺培南耐藥株的耐藥性能，IMP等碳青酶烯類抗菌藥物（MEM除外）進(jìn)入PA的主要特殊通道是D2，這就說明了D2缺少的耐藥表型為CAZ敏感/IMP耐藥/MEM敏感/復(fù)合紙片檢測陰性。除了這些之外，外排泵出在PA耐碳青酶烯類抗菌藥物中也有明顯的藥學(xué)作用[4]。為了進(jìn)一步提升臨床用藥的準(zhǔn)確性，應(yīng)根據(jù)患者實(shí)際治療需求提出藥物方案，同時(shí)擴(kuò)大各種藥物之間的靈活性，避免相應(yīng)產(chǎn)物對病況治療造成不當(dāng)。因此，金屬β-內(nèi)酰胺酶作為一種分離產(chǎn)物，需要進(jìn)行多方面的對比實(shí)驗(yàn)，才能獲得與其相對應(yīng)的藥性。

PA可產(chǎn)生多種金屬酶和其他碳青酶烯酶[5]，已報(bào)道的主要有IMP、 VIM兩種類型，最近在巴西發(fā)現(xiàn)一種不同于IMP和VIM的新的獲得性金屬β-內(nèi)酰胺酶Spm-1[6]。表1的結(jié)果顯示，本組PA亞胺培南耐藥株產(chǎn)4種金屬酶，其表型為IMP耐藥/復(fù)合紙片試驗(yàn)陽性，可能由于所產(chǎn)的MBL的類型不同，其表型亦存在差異。另外有7株P(guān)A產(chǎn)其他β碳青酶烯酶，其表型為CAZ敏感/IMP耐藥/MEM耐藥/復(fù)合紙片試驗(yàn)陰性。

表1可證明PA耐碳青酶烯類抗菌藥物的主要機(jī)制并非是產(chǎn)生MBL，然而絕大多數(shù)的金屬酶是經(jīng)由質(zhì)粒介導(dǎo)的，容易經(jīng)由不同的菌株間來達(dá)到轉(zhuǎn)導(dǎo)傳播，可對幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有高度的耐藥性，其中包括碳青酶烯類，而對于此類細(xì)菌所導(dǎo)致的重度感染，治療方案尚沒有理想選擇。如果再聯(lián)合其他耐藥機(jī)制，將會(huì)讓抗生素的選擇更加艱難。如果爆發(fā)此類銅綠假單胞菌導(dǎo)致的醫(yī)院感染，將會(huì)是非常難以處理的問題，因此應(yīng)對該問題投以高度的關(guān)注。

[1] Poirel L,NaasT,NicolasD,et al.Characterization of VIM-2,a carbapenem-hydrolyzing metallo-β-lactamase and its plasmid-and integron-born gene for a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(4):891-897.

[2] LeekA,LimB,YumJH,et al.BlaVIM-2 cassette-contaning novel integrons in metallo-β-lactamase-Producing Pseudomonas aeruginosa and pseudomonas putida isolates disseminated in a Korean hospital[J]. Antimicrob Agents Chemother,2002,46(4):1053-1058.

[3] 顧劍,彭少華,李從榮.獲得性金屬β-內(nèi)酰胺酶初篩方法的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2004,14(6):603-606.

[6] 張寫,張雅萍,肖光霞.銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)微生物分冊,2001,24(4):31-33.

[7] 熊薇,孫自鐮,申正義.銅綠假單胞菌的耐藥性及其耐喹諾酮機(jī)制的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2003,13(2):969-971.

[8] 林孟嫻,錢元恕.一種新的獲得性金屬β-內(nèi)酰胺酶Spm-1[J].國外醫(yī)學(xué)抗生素分冊,2005,26(3):83-85.

R97

B

1671-8194（2014）24-0188-02