雙波長HPLC測定非發(fā)酵豆制品中人工合成色素

曾玉梅，陳繁華，劉志輝

(梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗所，廣東梅州 514071)

目前，我們經(jīng)常食用的黃色系列的人工合成色素有檸檬黃及其鋁色淀、日落黃及其鋁色淀等。人工合成色素主要是從煤焦油中制取或以苯、甲苯、萘等芳香烴化合物為原料合成的有機色素［1］，種類多，色澤鮮艷，成本低廉，著色力強，因而被廣泛使用。不僅本身有毒，而且還夾雜著重金屬等劇毒物質(zhì)，故對人體健康尤其是兒童健康有不同程度的損害［2］。研究發(fā)現(xiàn)，包括酒石黃和日落黃在內(nèi)的7種人工色素可能會使兒童智商下降5分［3］。現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)［4］“食品中合成著色劑的測定”只是包括了飲料、果酒、著色糖果類成分簡單的試樣處理，直接用聚酰胺吸附色素法測定，并不適合高蛋白非發(fā)酵豆制品。

本文參考相關(guān)文獻［5-6］，采用石油醚去脂，用硫酸和鎢酸鈉溶液除去蛋白質(zhì)，聚酰胺粉吸附色素，洗滌后解吸、純化等處理樣品，用雙波長HPLC測定非發(fā)酵豆制品的人工合成色素，對是否非法添加進行評價。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.500 mg/mL(GBW(E)100003a 12003)、檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.500 mg/mL(GBW(E)100001a 12002)均由中國計量科學(xué)研究院提供;甲醇，色譜純;其余試劑均為分析純;樣品為我市7縣1區(qū)抽查:腐竹14批，豆腐10批。

島津LC-20A高效液相色譜儀，檢測器:日本島津SPD-20A;LC-20AT泵;Labsolution色譜工作站;AUW220D島津電子分析天平;HN1006超聲波清潔器。

1.2 樣品前處理

1.2.1 去脂和提取 取至少200 g樣品，用組織絞碎機絞碎。稱取絞碎的樣品5.0～10.0 g，置于小燒杯中，加入石油醚(30～60℃)50 mL，用玻棒攪拌，放置片刻，棄去石油醚。如此重復(fù)3次，除去脂肪，吹干。加入無水乙醇+氨水+水(7+2+1)提取著色劑，通過G3砂芯漏斗抽濾提取液，反復(fù)多次，至提取液無色為止。收集全部提取液于100 mL蒸發(fā)皿中。

1.2.2 沉淀蛋白質(zhì) 在70℃水浴上濃縮提取液至10 mL以下。依次加入1.0 mL硫酸溶液(1+9)和1.0 mL 100 g/L鎢酸鈉溶液，混勻，繼續(xù)70℃水浴加熱5 min，沉淀蛋白質(zhì)。取下蒸發(fā)皿，全部轉(zhuǎn)移至離心管中，離心10 min，上清液倒至100 mL燒杯中，取10 mL水清洗蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)移至上述離心管中，振搖30 s，離心10 min后，上清液合并入100 mL燒杯中。

1.2.3 純化 將上述合并清液加熱至70℃。將1.0～1.5 g聚酰胺粉(100～200目)加少許水調(diào)成粥狀，倒入試樣溶液中，使色素完全被吸附。將吸附色素的聚酰胺粉全部轉(zhuǎn)移到砂芯漏斗中，抽濾，用70℃的200 g/L檸檬酸溶液攪拌洗滌3～5次，然后用甲醇+甲酸(3+2)攪拌洗滌3～5次，至洗出液無色為止，再用水洗至流出液呈中性;用無水乙醇+氨水+水(7+2+1)解吸3～5次，每次5 mL，收集解吸液，蒸發(fā)至近干，加水溶解并定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

1.3 空白溶液

不加樣品，同法操作制備。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密吸取著色劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檸檬黃(0.500 mg/mL)0.8 mL、日落黃 (0.500 mg/mL)1.4 mL置100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱為Thermo ODS-2 HYPERSIL(150 mm×4.6 mm×5 μm)，柱 溫 30 ℃，流 動 相 甲 醇 (A)-0.02 mol/L 乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫(0 ～7 min，87%B→70%B;7～12 min，70%B→50%B;12～16 min，50%B→25%B;16 ～18 min，25%B→0%B;18 ～22 min，0%B→0%B;22 ～25 min，0%B→87%B;25 ～30 min，87%B→87%B);流速為1.0 mL/min，檢測波長485，427 nm，進樣量為20 μL。

1.6 測定

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液和空白溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算供試品中各著色劑的含量(必要時需扣除空白修正)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1，2，5，10，20，40 μL 注入液相色譜儀，按色譜條件測定，各平行進樣2次。以兩次峰面積平均值為縱坐標(biāo)、各色素的進樣量為橫坐標(biāo)作圖，進行線性回歸，得線性方程檸檬黃為Y=3 079.0X － 1 980.4(r=0.999 8)，日落黃為 Y=2 537.1X －1 507.1(r=1.000 0)，表明檸檬黃在進樣量4～160 ng范圍內(nèi)，日落黃在進樣量7～280 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC spectrum

2.2 儀器精密度實驗

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，按色譜條件測定，重復(fù)進樣5次，結(jié)果檸檬黃峰面積RSD為0.21%，日落黃峰面積RSD為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在24 h內(nèi)分別進樣20 μL進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，不同時間內(nèi)色譜峰面積基本一致，檸檬黃與日落黃峰面積的 RSD＜0.5%，表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在24 h穩(wěn)定。

2.4 回收率實驗

取6份空白豆制品，精密加入10 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按樣品前處理制樣進行測定，計算回收率，見表1。

表1 檸檬黃與日落黃回收率Table 1 The recovery rate of lemon yellow and sunset yellow

由表1可知，檸檬黃為100.9%(n=6)，日落黃為100.4%(n=6)。

2.5 檢出限

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用逐級稀釋法測定檢測限，按S/N=3 計，檢出濃度日落黃1.4 ng，檸檬黃0.8 ng。

2.6 討論

2.6.1 樣品前處理 非發(fā)酵豆制品都富含高蛋白，而油炸豆腐，特制腐竹中含有脂肪油類，王鑫等［7］直接用無水乙醇-氨水-水(70∶20∶10)提取，未去脂去蛋白，進入液相后較多雜質(zhì)干擾，蛋白質(zhì)進入液相后遇有機溶劑易變性，造成色譜柱堵塞，報廢率高。用石油醚去脂，用硫酸和鎢酸鈉溶液除去蛋白質(zhì)，聚酰胺粉吸附色素，洗滌后解吸，純化后進行測定，回收率實驗證明可排除干擾。

2.6.2 檢測波長 人工合成色素常用檢測波長254 nm，但不同成分相應(yīng)值差異較大，檢測的靈敏度較差［8］。實驗證明，使用254 nm，常有其它雜質(zhì)峰重疊到被測著色劑峰上無法分離，當(dāng)變更為485 nm(日落黃)，427 nm(檸檬黃)特征檢測波長測定時，即排除干擾，提高響應(yīng)值，獲得更低的檢出限。

2.6.3 洗脫方法 采用梯度洗脫，可縮短分析周期，提高分離能力，使峰型得到改善，增加靈敏度。

3 結(jié)論

2013年度我單位食品抽檢中，抽回非發(fā)酵豆制品24批次，其中腐竹14批，豆腐10批，經(jīng)檢驗后均未發(fā)現(xiàn)違法添加人工合成色素。

［1］易聲偉，朱永紅，屠大偉，等.高效液相色譜法同時測定飲料中十種著色劑［J］.食品與發(fā)酵科技，2013，49(3):68-71.

［2］顧曉莉.HPLC測定食品匯總?cè)斯ず铣缮兀跩］.吉林農(nóng)業(yè)，2013(4):78.

［3］葛宇.食品中人工合成色素使用法規(guī)及檢測標(biāo)準(zhǔn)進展［J］.質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化，2011(9):31-35.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5009.35—2003食品中人工合成色素的測定［S］.北京:北京標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［5］趙亞華，李勇，戎軍.食品中9種人工合成色素的高效液相色譜同時檢測法［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，23(5):1121-1124.

［6］雷霖.熟肉制品中人工合成色素含量的高效液相色譜測定法［J］.職業(yè)與健康，2013，29(2):184-188.

［7］王鑫，黃韜睿.非發(fā)酵豆制品中合成著色劑測定方法的研究［J］.生命科學(xué)儀器，2012，10(10):26-27.

［8］章家偉，吳公平，黎銀波，等.高效液相色譜法測定藥用輔料莧菜紅的含量［J］.藥物分析，2010，30(8):1590-1592.