米非司酮抑制人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖

郭永，趙愛華，蘇晨，3，丁寧，張瑤楠，劉慶＊，王乾興

（1．國家人口計生委科學技術(shù)研究所內(nèi)分泌室，北京 100081；2．解放軍第309醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100091；3．遵義醫(yī)學院細胞生物學與遺傳學教研室，遵義 563000）

米非司酮作為一種在臨床上廣泛使用的口服避孕藥，其分子機制仍有待于進一步深入研究。究其原因，在于作為米非司酮作用靶組織之一的人子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)復雜，人子宮內(nèi)膜主要由腺／腔上皮細胞、基質(zhì)細胞和細胞間質(zhì)等成分構(gòu)成。在人子宮內(nèi)膜中，包括子宮內(nèi)膜細胞的生理功能、細胞間的相互作用、各種細胞對性激素的應答等正常生理過程，及子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展的病理過程均在其中發(fā)揮作用。細胞體外培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應用于基礎研究、臨床實踐和生物工程等生命科學和醫(yī)學研究領(lǐng)域，也包括在生殖領(lǐng)域的運用。建立子宮內(nèi)膜細胞體外培養(yǎng)體系是對相關(guān)分子機制進行深入分析的較理想的實驗模型。但目前未有較好的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細胞系，因此，本研究擬通過組織分離原代培養(yǎng)的方法獲得人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細胞，從而建立一種簡單、高效的子宮內(nèi)膜細胞原代培養(yǎng)方法，同時分離培養(yǎng)高純度的基質(zhì)細胞和上皮細胞，旨在為研究子宮內(nèi)膜相關(guān)生理機制提供可靠的體外細胞實驗研究平臺。在此基礎上，我們將米非司酮直接作用于分離得到的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，以研究米非司酮對月經(jīng)周期中重要細胞——人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖的調(diào)控作用。

材料與方法

一、實驗材料

1．人子宮內(nèi)膜標本：5例，增殖期內(nèi)膜組織。取自年齡40～47歲的良性婦科疾病患者，患者月經(jīng)周期規(guī)律，無外科、內(nèi)分泌、免疫及代謝性疾病，手術(shù)前3個月內(nèi)未接受激素類藥物治療，術(shù)后均經(jīng)病理確診。

2．主 要 試 劑：米 非 司 酮 （Sigma，美 國）；DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）；PBS緩沖液、0．25%胰蛋白酶（GIBCO，美國）；活性炭處理胎牛血清（Wisent，加拿大）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（Amerosco，美國）；小鼠抗人波形蛋白抗體（R＆D，美國）；小鼠抗人角蛋白抗體（Dako，美國）；DNaseⅠ（Takara，日本）；異硫氰酸熒光素（FITC）-小鼠二抗（北京中杉金橋）。

二、實驗方法

1．人子宮內(nèi)膜細胞原代分離培養(yǎng)：參照Ryan等［1］的方法加以改良，具體操作步驟如下：在無菌的環(huán)境下，將取得的人子宮內(nèi)膜標本立即放入含青／鏈霉素的冰冷Hank’s液，洗滌3次；組織置于冰上，用眼科剪將組織剪成小于1mm×1mm×1mm大小組織塊，移入三角瓶中；加入適量的0．2%膠原酶消化液，37 ℃孵育1．5h，在孵育1h時，加入15U／ml DNaseⅠ繼續(xù)消化30min；消化過程中每隔20min，用渦旋器混勻一次；將消化后的細胞懸液通過50目篩網(wǎng)，濾去未消化的組織；再通過200目和400目篩網(wǎng)，濾液中以基質(zhì)細胞為主，400目篩網(wǎng)上以腺細胞團為主。

基質(zhì)細胞：濾液收集后，900r／min離心5min收獲細胞，臺盼蘭染色計數(shù)，接種密度為2．5×105個／ml。

上皮細胞：用Hank’s液反洗400目篩網(wǎng)，1 100 r／min離心2min，收集細胞或細胞團；900r／min離心5min后，棄上清，加入2ml 0．05%胰酶和15U／ml DNaseⅠ，吹打10min，使細胞團分散成單細胞；獲得細胞臺盼蘭染色，細胞計數(shù)，以5×105／ml密度接種。

基質(zhì)細胞接種后1．5h，將懸浮的細胞及上皮細胞團吸出，重新加入培養(yǎng)液，此時基質(zhì)細胞已帖壁；上皮細胞接種后2h，將懸浮的細胞及上皮細胞團吸出，轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)瓶中。基質(zhì)和上皮細胞培養(yǎng)液為DMEM／F12＋10%FBS（活性炭處理）。

2．人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細胞波形蛋白和角蛋白的鑒定

通過流式細胞術(shù)檢測方法，分別檢測人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細胞的波形蛋白和角蛋白表達陽性的細胞比率，鑒定分離培養(yǎng)的基質(zhì)和上皮細胞的純度。實驗步驟如下：0．25%胰酶消化，收獲細胞，細胞數(shù)不少于1×106個細胞；2%多聚甲醛固定15min；PBS洗滌2次，5min／次，1 100r／min離心收獲細胞；加入1%Triton X-100，室溫處理20min，PBS洗滌2次，3min／次；加入一抗工作液（小鼠抗人波形蛋白或小鼠抗人角蛋白抗體），37℃孵育1h；PBS洗滌3次，5min／次，加入熒光標記二抗工作液（FITC-小鼠二抗，1︰50），室溫避光反應45min；PBS洗滌3次，5min／次，用0．5ml PBS重懸細胞，進行流式檢測。以PBS代替一抗做為陰性對照。

3．MTT法檢測細胞半數(shù)抑制濃度（IC50）：取對數(shù)生長期的原代分離培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，用0．25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，分別以DMEM／F12培養(yǎng)基（含10%活性炭處理FBS）調(diào)整細胞懸液濃度為4×104個／ml，接種于96孔板，每孔100μl，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，加入米非司酮試劑，使其終濃度分別 為 0．01、0．1、0．5、1、2．5、10、25、50 和 100 μmol／L，并設立空白組（不接種細胞）、對照組（接種細胞，但不加米非司酮）。每個濃度設置6個復孔。分別將培養(yǎng)板放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d和3d，各孔均加入 20μl MTT 溶液 （5mg／ml，即 0．5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490nm處測量各孔的吸光值（OD值）。取6個孔的OD值均數(shù)，按公式計算細胞抑制率（IR）＝（對照組OD值－實驗組OD值）／對照組OD值×100%。以平均抑制率為Y軸，米非司酮濃度為X軸分別繪制米非司酮濃度對兩種細胞抑制率的散點圖。通過直線回歸計算米非司酮對原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的IC50。

三、統(tǒng)計學方法

實驗結(jié)果采用SPSS 17．0軟件進行分析，流式檢測結(jié)果以（±s）表示，IR值采用直線回歸分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細胞的形態(tài)學觀察

分離所得基質(zhì)細胞主要為單個細胞，在1h左右迅速貼壁，剛貼壁基質(zhì)細胞多呈三角形，以2．5×105／ml密度接種細胞，細胞生長迅速，4～5d即可長滿培養(yǎng)板，細胞呈長梭形或紡錘形（圖1A），相互平行排列成束。基質(zhì)細胞至少可穩(wěn)定傳4代。

分離所得上皮細胞呈團狀聚集生長，貼壁較慢，2～3h開始貼壁。剛貼壁的上皮細胞呈蝌蚪形，2d后，細胞出現(xiàn)漩渦狀排列，團簇生長，最后生長成片。以5×105個／ml密度接種細胞，6～7d可長滿培養(yǎng)板（圖1B），生長速度較基質(zhì)細胞慢。上皮細胞傳代后細胞生長狀態(tài)較差。

二、細胞鑒定及純度檢測結(jié)果

利用抗基質(zhì)細胞特異表達的波形蛋白抗體和抗上皮細胞特異表達的角蛋白抗體，鑒定分離培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和上皮細胞，并通過流式細胞術(shù)檢測波形蛋白和角蛋白陽性細胞比率，計算分離培養(yǎng)的細胞純度。以不加一抗的細胞作為陰性對照，通過參數(shù)設定，選定流式分析的細胞范圍（圖2）。熒光信號分析結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)基質(zhì)細胞波形蛋白陽性率達97%，上皮細胞角蛋白陽性率達90%（表1）。說明通過該原代細胞分離方法可獲得高純度人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和上皮細胞。

圖1 原代分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細胞形態(tài)觀察（200×）

三、米非司酮對原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞IC50檢測結(jié)果

米非司酮作用于原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞2d后，隨著米非司酮濃度增加，基質(zhì)細胞IR值逐漸增高，其中，米非司酮濃度為50μmol／L和100μmol／L的實驗組的IR值高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；米非司酮作用3d后，對原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞抑制作用更明顯，米非司酮濃度為25、50和100μmol／L各組的IR值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。對米非司酮處理2d和3d原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞抑制率進行直線回歸分析，米非司酮處理2d對原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的IC50為52．85μmol／L，米非司酮處理3d對原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的IC50為86．46μmol／L（圖3）。

圖2 流式細胞術(shù)檢測波形蛋白和角蛋白表達的熒光峰型圖

表1 分離培養(yǎng)細胞的波形蛋白和角蛋白陽性率（%）

圖3 不同濃度米非司酮對原代人子宮內(nèi)膜細胞的生長抑制率比較

討 論

目前，人子宮內(nèi)膜分離方法多采用二次過濾法，即先將消化好的混懸液過200目濾網(wǎng)，以除去粘液和未消化組織，再過400目濾網(wǎng)，400目濾網(wǎng)上面為未消化的腺上皮細胞團，反沖濾網(wǎng)獲得腺體細胞團，而濾液中富含基質(zhì)細胞。這種方法不但無法獲得高純度的基質(zhì)細胞和上皮細胞，并且腺上皮細胞團直接接種不易貼壁，存活率低，造成樣本的浪費。本部分實驗采用“二次酶消化－二次過濾－差時貼壁”的方法分離得到了高純度、高產(chǎn)量的基質(zhì)細胞和上皮細胞。具體過程是在上述方法研究基礎上，將得到的上皮細胞團再用0．05%胰酶二次消化，可得到單個上皮細胞，單細胞極易貼壁，存活率高。另外，由于基質(zhì)和上皮細胞貼壁時間存在差異，基質(zhì)細胞在接種2h內(nèi)即可完全貼壁，而上皮則是在2h后開始貼壁，因此，利用兩種細胞貼壁時間不同的特性，在細胞接種后1．5～2h進行細胞換液，可有效提高基質(zhì)和上皮細胞純度。

一直以來，研究者都將波形蛋白和角蛋白作為鑒別基質(zhì)細胞和上皮細胞的標識物分子。Mathews等［2］發(fā)現(xiàn)波形蛋白同時表達于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和上皮細胞。本研究結(jié)果顯示，分離獲得的上皮細胞中波形蛋白呈陽性，陽性率為（71．3±18．6）%。因此，本研究也證實波形蛋白不僅表達于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，同時還表達于上皮細胞，。因而，波形蛋白不能作為唯一鑒別基質(zhì)細胞和上皮細胞的依據(jù)。目前的研究中，細胞鑒別實驗多采用波形蛋白和角蛋白免疫組織化學染色，該方法步驟繁瑣，可鑒別細胞數(shù)量有限，并且通過人工計數(shù)等方式計算陽性率，操作繁瑣，誤差大。本研究采用流式細胞術(shù)，同時檢測波形蛋白和角蛋白表達情況。該方法測定的細胞數(shù)量大，細胞數(shù)量大于1×106個，同一群細胞同時檢測波形蛋白和角蛋白表達，熒光信號敏感，計數(shù)精確。流式結(jié)果顯示，本研究分離得到的基質(zhì)細胞純度達97%，上皮細胞純度達90%，并且收獲細胞數(shù)量多，標本利用率高。

米非司酮是1981年由法國的Roussel-Uclaf公司開發(fā)的一種人工合成的炔諾酮衍生物。經(jīng)過30多年的摸索實踐，米非司酮廣泛地運用于臨床，例如終止早孕、緊急避孕、藥物流產(chǎn)和治療抑郁癥、腦膜瘤、阿爾茲海默綜合征、庫欣綜合征等領(lǐng)域［3－5］。在米非司酮避孕機制研究中，目前文獻報道呈現(xiàn)的結(jié)果大多為內(nèi)膜組織切片的形態(tài)觀察和免疫組織化學檢測，干擾實驗結(jié)果的因素較多，不利于分子機制探索，因此，亟待良好的子宮內(nèi)膜細胞模型的建立，以為避孕分子機制的研究奠定基礎。

之前關(guān)于米非司酮在子宮內(nèi)膜中作用的研究提出，米非司酮抑制子宮內(nèi)膜生長和分泌期改變，而更多是停留在現(xiàn)象的觀察［6－7］，近期更多地側(cè)重在分子水平上解釋有關(guān)米非司酮作用下游相關(guān)的信號通路以及miRNA調(diào)控作用［8－11］。在本研究中，在獲得高純度的人子宮內(nèi)膜基礎上，采用米非司酮處理原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，觀察在體外米非司酮對原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖的影響。結(jié)果顯示米非司酮作用于原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞2d和3d后，抑制原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞生長，其抑制率均隨著米非司酮濃度的增加而升高，存在明顯的量效關(guān)系。我們在前期研究中也發(fā)現(xiàn)米非司酮發(fā)揮作用與其使用劑量和時間密切相關(guān)［12］。抑制率直線回歸分析結(jié)果表明，米非司酮處理2d和3d后，原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的IC50分別為 52．85μmol／L 和86．46μmol／L。

綜上所述，我們采用二次酶消化－二次過濾－差時貼壁的方法獲得了純度分別達97%和90%的高純度、高產(chǎn)量的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和上皮細胞，為后續(xù)細胞水平的研究提供了技術(shù)上的支持和保障。在此基礎上，我們對米非司酮避孕分子機制進行了初步研究，結(jié)果表明米非司酮能夠抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的增殖，也為深入研究子宮內(nèi)膜細胞在避孕藥物發(fā)揮作用的過程中扮演著的細胞角色和相關(guān)分子機制的研究奠定了基礎。

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