全反式維甲酸對卵巢癌SKOV3細胞增殖、分化的影響

張海娟，楊玉秀

(石家莊市第四醫院，石家莊050017)

自1971年Friend等發現二甲基亞砜可誘導小鼠紅白血病細胞分化為成熟紅細胞而產生血紅蛋白以來，誘導分化作為一種治療惡性腫瘤的有效方法引起了人們的重視。維甲酸類化合物是常用的誘導分化劑，對多種惡性腫瘤具有誘導分化、抑制增殖、誘導腫瘤細胞凋亡的作用［1］。全反式維甲酸(ATRA)是維生素A的天然衍生物及生物活性形式，能誘導多種腫瘤細胞分化或抑制腫瘤細胞增殖［2］。為探討ATRA對卵巢癌SKOV3細胞的抑制增殖和誘導分化作用，2009年1～12月，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3細胞株購自北京大學人民醫院。RPMI-1640培養基購自GIBCO BRL公司;MTT購自Singma公司。鼠抗人分化相關基因1(NDRG1)單克隆抗體購自DBS公司;SP試劑盒和DAB顯色劑購自北京中山生物公司。ATRA購自Sigma公司;酶標儀購自Absystems Dragon公司;流式細胞分析儀購自BD Facscalibur公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 以1×10－6mol/L的ATRA處理人卵巢癌 SKOV3細胞 1、2、3、5 d為實驗組，不加ATRA處理細胞為對照組。將SKOV3細胞置于RPMI-1640培養基中，加入10%的新生牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素。細胞培養用50 mL培養瓶，在5%CO2、37℃飽和濕度的溫箱中培養，細胞生長達匯合狀態時，用0.04%EDTA消化后傳代。

1.2.2 細胞增殖抑制率測定 采用MTT比色法。取對數生長期細胞，消化后加培養液吹打均勻，以1×105/mL細胞密度接種于96孔培養板，每孔加入100 μL細胞懸液，24 h后加入ATRA儲存液，并用RPMI-1640培養液調終濃度為1×10－6mol/L。實驗組每組設6復孔，24 h更換培養液，分別將ATRA作用1、2、3、5 d后的細胞進行測定，向每孔培養液中加入5 mg/mL的MTT 20 μL，小心吸去上清，4 h后每孔加150 μL DMSO液終止反應，用酶標儀測490 nm波長的吸光度(A值)，計算細胞增殖抑制率。同時設空白對照孔。

1.2.3 細胞周期分布檢測 收集兩組懸浮細胞和貼壁細胞，細胞數不低于1×106個，離心后棄上清，用冷PBS漂洗，冷乙醇固定，在4℃冰箱中過夜。次日離心棄乙醇，用PBS漂洗后，上流式細胞儀進行細胞周期檢測。

1.2.4 SKOV3細胞中的NDRG1蛋白表達檢測采用免疫組化SP法。取兩組細胞爬片標本，嚴格按照試劑盒說明檢測兩組NDRG1蛋白表達。用冷丙酮固定，PBS沖洗，1%的Triton修復暴露抗原，10%山羊血清封閉非特異性結合位點;滴加適當稀釋的一抗，置37℃溫箱孵育2 h或4℃冰箱過夜，依次滴加二抗、三抗，行DAB顯色、蘇木精復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在倒置顯微鏡下觀察兩組細胞形態變化，NDRG1蛋白表達陽性著色呈棕黃色或黃色顆粒，位于細胞質及細胞核周圍。每組隨機選取30個視野，用雙評分半定量法評分:①按陽性細胞百分率計分:陽性細胞百分率≤5%計0分，6% ～25%記1分，26% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計4分。②按染色強度計分:無著色計0分，淡棕黃色或黃色計1分，棕黃色或黃色計2分。兩項合并得0分為陰性(－)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗;計數資料用百分比表示，組間比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATRA作用不同時間點的A值比較 見表1。實驗組各時間點的A值均明顯低于對照組(P均＜0.05);實驗組 ATRA 作用后1、2、3、5 d，其細胞增殖抑制率分別為 16.7%、20.9%、23.1%、28.6%，兩兩比較P均＜0.05。

表1 兩組ATRA作用不同時間點的A值比較(±s)

表1 兩組ATRA作用不同時間點的A值比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別ATRA作用后A值1 d 2 d 3 d 5 d對照組0.30 ±0.08 0.48 ±0.05 0.52 ±0.02 0.63 ±0.09實驗組 0.25 ±0.03*0.38 ±0.06*0.40 ±0.09*0.45 ±0.04*

2.2 兩組細胞周期比較 對照組細胞周期為G1/G0期(50.1 ±0.9)%、S期(28.4 ±0.25)%;實驗組1、2、3、5 d 的 G1/G0期細胞分別為 (58.2 ±0.38)%、(62.9 ±0.32)%、(65.4 ±0.12)%、(68.9±0.41)%，S 期細胞分別為(25.1 ±0.49)%、(22.9±0.33)%、(21.0 ±0.51)%、(19.2 ±0.18)%。與對照組比較，實驗組G1/G0期細胞增多，S期細胞減少(P 均＜0.05)。

2.3 兩組NDRG1蛋白表達比較 見表2。

表2 兩組NDRG1蛋白表達比較

2.4 細胞形態變化 倒置顯微鏡下，對照組細胞大小均勻，貼壁生長。實驗組細胞生長緩慢，數量減少，細胞大小不一，形態不規則，貼壁能力減弱，細胞膜絨毛減少，細胞核光滑無切跡，分裂像少見，凋亡細胞較多。

3 討論

誘導分化是指惡性腫瘤細胞在體外分化誘導劑作用下，向正常或接近正常細胞方向分化逆轉的現象。維甲類化合物具有較好的誘導分化和增殖抑制作用，其主要通過誘導核維甲酸受體表達起作用，同時抑制異常角化，調節癌基因和抑癌基因表達［3，4］，其代表藥物是ATRA。研究表明，ATRA能誘導多種腫瘤細胞分化或抑制腫瘤細胞增殖。上世紀80年代王振義等［5］首先用ATRA治療急性早幼粒細胞白血病，取得較高的緩解率。本研究發現，ATRA可抑制SKOV3細胞生長，且隨時間延長其抑制作用明顯，提示ATRA有較強的抑制癌細胞增殖和誘導其分化作用。

有研究表明，細胞周期長短主要決定于G1期，G1期阻滯可使細胞周期延長，導致細胞增殖減慢，Inui等［6］研究表明ATRA可影響細胞DNA的合成，改變細胞周期和信號傳導途徑，使細胞在G1期前停滯。本研究顯示，ATRA作用于SKOV3細胞后，G1/G0期細胞增多，S期細胞減少，說明ATRA能阻止細胞由G1/G0期向S期轉化，延長細胞分裂周期，抑制細胞增殖，與駱霞崗等［7］在研究ATRA對人胰腺癌細胞PC-3誘導分化作用中的結論相同。本研究還發現，ATRA處理后的細胞在形態學上出現了良性分化表現，即細胞增殖受抑制，細胞數量減少，細胞貼壁能力減弱，細胞膜絨毛減少，細胞核分裂像少見，凋亡細胞較多，與張強等［8，9］觀察 ATRA 對人骨肉瘤細胞影響的結果相似。

NDRG1基因是新發現的與細胞分化有關的基因，廣泛存在于人體各組織中，在其生長過程中起重要作用。Kurdistani等［10］發現，NDRG1基因在乳腺癌、前列腺癌細胞株及腫瘤組織中呈低表達，其過表達可抑制腫瘤細胞生長。研究表明，NDRG1可被多種分化調節劑誘導表達，如缺氧及鎳化合物、維甲酸、維生素 D3等可使其 mRNA或蛋白表達上調［11，12］。1999 年 Piquemal等［13］曾報道用多種分化誘導劑處理白血病細胞株U937，發現NDRG1蛋白表達出現上調。本研究發現，ATRA作用于SKOV3細胞后，NDRG1蛋白表達高于對照組，提示ATRA有誘導NDRG1表達的作用，表明NDRG1參與了卵巢癌細胞的誘導分化，維甲酸可能通過調節其表達而促進細胞分化、抑制細胞增殖。

綜上所述，ATRA有抑制卵巢癌細胞增殖、誘導其分化的作用，將誘導分化治療作為卵巢癌的綜合治療方法具有現實意義。

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