熒光定量PCR檢測HBV－DNA、HCV－RNA室內質控物的制備及評估

葛詠梅，馮曉朦，周勁松，高 申＊

熒光定量PCR檢測HBV－DNA、HCV－RNA室內質控物的制備及評估

葛詠梅1，馮曉朦2，周勁松2，高 申2＊

（1.吉林省人民醫院，吉林長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院）

熒光定量PCR法檢測人血漿中乙肝HBVDNA、HCV－RNA具有較高的靈敏度和較強的特異性［1］，但是檢測的結果易受很多因素影響，因此嚴格的室內質量控制才能預防和控制檢驗誤差，保證結果的準確性。目前，PCR檢測試劑盒并未提供定值的室內質控品，且商用質控品的價格昂貴、不易獲得，給常規PCR檢測過程中室內質量控制帶來不便。根據衛生部臨檢中心對質控品的相關規定，結合近年來臨床PCR工作的基礎，我們應用混合血清自制單一模式的混合血清實驗室室內質控品，并根據《體外診斷試劑注冊管理辦法》（試行）等相關文件要求對其準確性、穩定性進行了初步評價，報告如下。

1 材料與方法

1.1標本采集

2012年6月—11月在我院住院和門診患者血清中，分別選取60例HBsAg、HBeAg、抗HBc陽性、60例Hcv－Ab陽性的患者標本，選取200例乙肝、丙肝標志物均陰性的患者標本，所選取的標本均無黃疸、溶血、脂血、高IgG。

收集的陽性標本于56℃水浴箱中30min滅活，離心后收集上層血清，0.5ml／支分裝，于－70℃冰箱中保存待測，避免反復凍融。

1.2主要儀器與試劑

LightCycler480熒光PCR基因擴增檢測儀，深圳匹基生物工程有限公司的HBV－DNA、HCVRNA熒光定量PCR試劑盒。

1.3單一模式混合血清的制備

200例乙肝標志物均陰性標本的混合血清，作為基質血清；60例HBsAg、HBeAg、抗HBc均陽性標本的混合血清，記做模式①，60例Hcv－Ab陽性標本的混合血清，記做模式②。將模式①，模式②的病毒濃度測定3－4次，取其平均值。用基質血清通過1∶10、1∶100、1∶1000稀釋后，檢測3－4次，平均值及預期靶值。0.5ml／支分裝，于－70℃冰箱中保存備用。

1.4確定靶值繪制質控圖

使用相同的儀器及同一品牌的試劑盒在同一反應條件下進行檢測，每次平行測定3個反應，連續檢測20日，確定其靶值，計算x—、s、CV，并繪制質控圖。

1.5均一性實驗

任意抽取樣本各30支，進行編號。從每支樣本中取200μl，共6ml充分混勻，用于批內不精密度的檢測，共檢測30次。1－30號樣本分別進行檢測，每份樣本檢測1次，計算測定（總）不精密度。該檢測為同一人操作，同一條件下，1次上機完成［2］。

1.6穩定性實驗

1.6.1 分別取樣本各20支共40支，分為4組，每組10支包括5支HBV－DNA、5支HCV－RNA，分別按照以下放置樣本條件放置。放置條件：①室溫（20－25℃），相對濕度20%－50%，3d；②冰箱冷藏（2－8℃），5d；③－20℃14d；④－70℃（不同條件下穩定性對照組）。

1.6.2 隨機抽取20支樣本－20℃凍存，12個月內不定期檢測，每次抽取2支，復融，室溫放置15 min，漩渦振蕩混勻。每份樣本從核酸提取開始平行做2份。以－70℃凍存的樣本作為長期保存穩定性對照組，與－20℃保存時的檢測值作比較，監測制備物長期保存時HBV DNA的含量變化。

1.7質控品的評估

1.7.1 生物安全性 在本實驗制備前，將所用血清均按照常規方法進行56℃30min滅活備用，保證質控血清無已知的生物傳染性。

1.7.2 質控品的準確性 本實驗室為國家標準實驗室，在常規工作條件下，由熟練的技術人員對自制的質控血清進行檢測，經衛生部臨檢中心頒布的國家標準品溯源定值，結果一致。

1.8統計分析

按文獻［3］方法計算x—、s、CV值。均一性實驗檢測采用方差齊性檢驗，穩定性試驗檢測采用t檢驗。

2 結果

2.1質控品的預期靶值

使用基質血清稀釋的室內質控物的預期靶值見表1。

表1 最佳稀釋倍數下所測得的HBV－DNA、HCV－RNA拷貝數

2.2質控品定值

在常規條件下，由熟練的技術人員對自制的質控血清進行檢測20次，計算x—、s、CV值，確定質控品的預期靶值，詳見表2。

表2 自制質控品參數

2.3均一性實驗檢測

對混合樣本檢測30次的數據和30份樣本的檢測數據進行統計，將兩組數據作方差齊性檢驗，批內精密度和總精密度差異無統計學意義（F（HBV）＝1.0250、F（HCV）＝1.0240，P值均＞0.05），符合均勻性要求（表3）。

表3 均一性實驗結果

2.4穩定性實驗結果

不同條件下放置質控物結果P值均＞0.05，差異無統計學意義（表4）。對質控物的穩定性進行長期監測，12個月不定期分別對制備物HBV－DNA、 HCV－RNA監測12次，各組間t（HBV－DNA）＝0.949，t（HCV－RNA）＝0.926，P均＞0.05，無統計學差異，表明該定值制備物長期保存含量無明顯變化。具有很好的穩定性和長期保存性（表5）。

表4 不同條件下放置質控物結果

表5 不定期檢測HBV－DNA、HCV－RNA拷貝數

3 討論

病毒性肝炎嚴重威脅人類健康，尤其是乙型肝炎在我國流行廣泛，因此肝炎的診斷和治療顯得格外重要。目前臨床實驗室多采用熒光定量PCR方法檢測，提高HBV－DNA、HCV－RNA熒光定量PCR檢測的靈敏度與精確度，對臨床乙型肝炎的診斷及預后有極其重要的用。

為了保證熒光定量PCR法進行病毒DNA定量檢測的準確性，應嚴格按照實驗室標準操作程序（SOP），建立和完善室內質控物，提高常規工作的批內、批間標本的一致性。

理想的室內質控樣本的條件為：基質與待測標本一致，所含待測物濃度應接近試驗的決定水平，有很好的穩定性，靶值或預期結果已定，無已知的生物傳染危險性，單批可大量獲得［4］。

本研究自制的質控品為單一模式的混合血清，且在實驗前經過常規滅活，達到無生物傳染性，并在通過國家標準的實驗室條件下，由熟練的技術員進行熒光定量PCR檢測，該定值質控品的測量準確度不低于國家標準、行業標準的規定，具有可信度。均一性實驗結果顯示，批內精密度和總精密度差異無統計學意義；穩定性實驗結果表明，自制血清穩定，且長期保存含量無明顯變化，達到國家對質控品制備要求的相關規定。且根據《分子診斷項目分析性能標準》自建檢測系統不精密度要求：以能力驗證／室間質評評價界限（靶值±0.4對數值）作為允許總誤差（TEa），重復性精密度＜3／5TEa；中間精密度＜4／5TEa。按照項目穩定性要求選取最長期限樣品，5個樣品，覆蓋測量區間，至少4個樣品測量結果偏倚＜±7.5%，本質控品均達到要求。

因此通過本實驗方法自制熒光定量PCR檢測HBV－DNA、HCV－RNA的室內質控物，實驗室的質量控制提供了基本的保障，也節約了實驗室的成本。應用于臨床乙型、丙型肝炎的檢測的室內質控，為臨床出具更多及時、準確的檢驗報告，具有很大的意義。

［1］H o SK，Yam WC，Leung EK，et al.Raped quantification of hepatitisB virus DNA by real－time PCR using fluorescent hybrid ization probes［J］.J Med Microbiol，2003，52：397.

［2］王露楠，鄧 巍，申子瑜，等.乙型肝炎病毒DNA標準物質的研究［J］.中華肝臟病雜志，2007，15（2）：107.

［3］CNAS－GL26：2008.中國合格評定國家認可委員會.醫學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的指南［S］.

［4］李金明.實時熒光PCR技術［M］.北京：人民軍醫出版社，2007：190.

2014－01－17）

1007－4287（2014）12－2024－03

＊通訊作者