乙型病毒性肝炎肝硬化、原發性肝癌患者外周血調節性B細胞檢測

孫 健，陳軍浩，張 葵，曹小利

乙型病毒性肝炎肝硬化、原發性肝癌患者外周血調節性B細胞檢測

孫 健，陳軍浩，張 葵＊，曹小利

（南京大學醫學院附屬鼓樓醫院檢驗科，江蘇南京210008）

目的檢測乙肝肝硬化、原發性肝癌患者外周血調節性B細胞（Breg）的比率，了解Breg與肝硬化、肝癌疾病之間的關系。方法以CD19＋CD5＋CD1d＋作為Breg標記，流式細胞術檢測24例乙肝肝硬化患者、28例肝癌患者和20名健康對照者外周血Breg占B淋巴細胞的比率。結果肝硬化患者組Breg比率（29.90±9.19）%和肝癌患者組Breg比率（31.34±8.99）%均顯著高于健康對照組（22.50±6.52）%，分別為P＝0.016和P＝0.003；肝硬化患者組和肝癌患者組間Breg比率無統計學意義（P＞0.05）。結論與對照組比較，Breg比率在肝硬化、肝癌患者外周血中顯著升高，提示Breg細胞增加，與肝硬化、肝癌B細胞免疫調節紊亂相關。

調節性B細胞；乙型肝炎；肝硬化；原發性肝癌；流式細胞術

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1975）

乙型肝炎病毒（HBV）持續感染是引起乙肝慢性化遷延化及肝硬化（liver cirrhosis，LC）的主要原因，原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）與由HBV長期感染導致的大結節性肝硬化有著直接的密切關系。在我國，感染HBV的人群中有10%－20%五年內將發展成肝硬化［1］，90%的原發性肝癌發生在肝炎肝硬化的基礎上，其中95%肝癌患者具有HBV感染背景。B淋巴細胞參與調控和（或）誘導T淋巴細胞免疫應答而與肝硬化、肝癌疾病關系密切［2－5］，調節性B細胞（regulatory B cell，Breg）作為B淋巴細胞亞群，其表型CD19＋CD5＋CD1d＋得到國際公認［6］。Breg近年來廣受關注，其主要功能是調節炎癥過程，抑制過度炎癥反應，是免疫排斥、自身免疫病及免疫功能紊亂狀態下的重要的保護性細胞，同時也參與腫瘤、感染性疾病的免疫調節，目前在多種疾病中已見Breg的相關報道，但Breg與肝硬化、肝癌疾病的關系未見報道。本文通過對乙肝肝硬化、原發性肝癌患者外周血Breg亞群檢測，進一步了解Breg在肝硬化、肝癌疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1研究對象24例乙肝肝硬化患者和28例原發性肝癌患者為南京大學醫學院附屬鼓樓醫院已確診的住院患者。乙肝肝硬化患者男性19例；女性5例，年齡26－72歲，平均年齡53歲，其中HBsAg，HBeAg，HBcAb陽性7例；HBsAg，HBeAb，HB－cAb陽性14例；HBsAg，HBcAb陽性3例，所有患者均經肝組織病理活檢以及經臨床、生化和影像學診斷明確確診為LC。原發性肝癌患者男性18例；女性10例，年齡34－76歲，平均年齡56歲，其中19例患者AFP＞1 000ng／ml；6例患者AFP＝20－1 000ng／ml；3例患者AFP＜20ng／ml，所有患者均有LC病史，經病理活檢、血清AFP、影像學診斷明確為PLC。20名對照者為鼓樓醫院體檢健康者，其中男13名；女7名，年齡22－70歲，平均年齡52歲。空腹采集靜脈血2.0ml，以乙二胺四乙酸鉀（EDTA－K2）抗凝。

1.2儀器與試劑流式細胞儀（BD FACScalibur）；Anti－human CD1d－APC（Clone：51.1）和同型對照Mouse IgG2b－APC為eBioscience公司產品；CD45－PreCP／CD19－FITC／CD5－PE、同型對照IgG1－PE和溶血素（FACSLysing Solution）均為BD Biosciences公司產品；鞘液使用Backman－Coulter公司ISOTONⅢ血細胞稀釋液。

1.3檢測方法取CD45－PreCP／CD19－FITC／CD5－PE／CD1d－APC單抗各10μl加入流式專用試管底部，以CD45－PreCP／CD19－FITC／CD1d－APC／IgG1－PE各10μl作為CD5－PE同型對照管、CD45－PreCP／CD19－FITC／IgG－APC／CD5－PE各10μl作為CD1d－APC同型對照管。每管加入EDTA－K2抗凝全血100μl，旋渦混勻后，置室溫避光反應15 min，然后加入溶血素2.0ml，旋渦混勻，室溫避光溶血5min后以1 500r／min離心5min，棄上清液，加入鞘液2.0ml，旋渦混勻后1 500r／min離心5 min，棄上清液，加400μl鞘液，混勻后流式細胞儀檢測。

1.4流式細胞儀分析在側向角（SSC）／CD45設“門”于淋巴細胞“R1”，將其“Format”至另一散點圖SSC／CD19上設“門”于B細胞“R2”。另設邏輯門G3＝R1and R2，“Format”G3至CD5／CD1d散點圖中，進行Breg（CD19＋CD5＋CD1d＋）亞群檢測。用Cell Quest軟件獲取50000個以上細胞數據，分析外周血Breg亞群的百分率，結果以百分比表示。

1.5統計學方法實驗數據使用均數標準差（ˉx± s）表示，采用SPSS 16.0統計軟件分析，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間比較用LSD檢驗，方差不齊時用Tamhane’s T2檢驗。組間P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1流式細胞術檢測Breg亞群使用CD45－Pre－CP／CD19－FITC／CD5－PE／CD1d－APC單克隆抗體免疫標記，參照同型對照結果，通過流式細胞術可以清楚檢測到Breg（CD19＋CD5＋CD1d＋）亞群表達比率。結果見圖1。

圖1 流式細胞術分析調節性B細胞亞群散點圖

2.2LC患者組、PLC患者組與健康對照組Breg亞群的比較24例LC患者外周血Breg比率（29.90 ±9.19）%和28例PLC患者Breg比率（31.34± 8.99%均顯著高于健康對照組（22.50±6.52）%，分別為P＝0.016和P＝0.003；肝硬化患者組和肝癌患者組間Breg比率無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1 調節性B細胞亞群水平比較（ˉx±s）

3 討論

LC和PLC在我國屬于常見病、多發病，HBV感染是兩者的主要危險致病因素。慢性乙肝－肝硬化－肝癌三步曲的發展轉變過程中，相關的免疫學機制復雜，多數研究者認為與機體的免疫應答及調控紊亂有密切的關系。過去許多研究顯示，T淋巴細胞免疫功能紊亂是疾病發生發展的重要原因，主要表現為患者外周血CD4＋CD8＋細胞數及比例紊亂［7］；Th1／Th2平衡調節紊亂［7］；Treg和Th17免疫調節紊亂［8，9］。B細胞作為免疫活性細胞主要的功能是產生特異性抗體，在抗感染免疫過程中發揮重要作用。隨著研究的不斷深入，B細胞其它的功能也越來越多的被揭示。B細胞的免疫調節作用由Wolf等人［10］在研究急性實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）時提出，隨后Filatreau等［11］發現B細胞在IL－10缺乏的情況對EAE的發生有促進作用。2006年，Mizoguchi等［12］首先使用調節性B細胞的概念來定義這群具有負向調節功能的B細胞群體。2008年，Yanaba等［5］在研究小鼠CHS模型時首次證實這種特殊細胞亞群的存在，以CD19＋CD5＋CD1d＋為表型特點，也是第一種被證實的Breg亞群。Breg又名B10細胞，通過分泌白介素IL－10誘導Th0細胞向Th2分化、抑制Th1的分化而影響Th1／Th2的平衡，并且抑制Th17細胞的誘導和募集Treg、NKT等抑制性細胞［13－15］，參與介導病毒感染及腫瘤的免疫應答。

目前對于人體Breg表型的研究尚無定論，疾病不同表型不同；同一表型在不同疾病中的作用也不同。Breg可能不僅是某一種特定標志的細胞群，而是多組不同亞群的集合，CD19＋CD5＋CD1d＋亞群是其中主要的代表，我們的實驗僅對（CD19＋CD5＋CD1d＋）Breg亞群進行研究。在對外周血Breg占B淋巴細胞的比率分析后我們發現，LC和PLC患者Breg亞群比率均顯著高于健康對照組，提示在LC和PLC患者體內不僅存在上文所提的T細胞免疫調節紊亂，而且同時存在B細胞免疫調節紊亂，并且兩組患者Breg免疫紊亂的傾向是一致的。導致患者Breg比率升高的原因可能有：①患者體內B細胞數高增殖［2，3］和活化B細胞高表達［4］，反饋性的增加和活化Breg數量；②患者B1（CD5＋B）細胞顯著增加［5］，B1細胞分為B1a和B1b，B1a細胞在自身免疫性等疾病的發病和進展中起重要作用并具有產生IL－10的能力，因此多數學者認為Breg源自B1a細胞［16］；③患者存在的T細胞免疫調節紊亂誘使機體產生更多的Breg對抗平衡失調，影響T細胞對病毒感染和腫瘤的攻擊。本次研究沒有發現LC和PLC患者組間Breg亞群存在顯著性差異，原因可能有：①PLC患者經歷過或合并有LC疾病，具有與LC相似的免疫環境；②研究的樣本量不夠多。③外周血部分Breg募集到癌組織中，導致外周血Breg差異不顯著。

綜上所述，LC和PLC患者外周血Breg亞群均顯著升高，提示Breg與肝硬化、肝癌B細胞免疫調節紊亂相關。LC和PLC患者之間Breg亞群比較由于受臨床樣本量的限制，尚需進行大樣本的臨床觀察以及對肝臟局部組織的研究以進一步了解Breg在LC和PLC間轉化的作用與意義。

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Detection of regulatory B cells among Peripheral blood from patients diagnosed as primary liver cancer and Hepatitis B with Cirrhosis

SUN Jian，CHEN Jun－hao，ZHANG Kui，et al.（Department of Laboratory，Gulou Affiliated Hospital of Medical College of Nanjing University，Nanjing210008，China）

ObjectiveTo explore the relationship bewteen regulatory B cells（Breg）with liver cirrhosis and Hepatic carcinomaby analyzing the proportions of Bregs.MethodsTaking CD19＋CD5＋CD1d＋as the marker of the Breg，Flow cytometry was implemented to determine the proportions of Bregs among the B lymphocytes from the 24patients with liver cirrhosis，28ones with Hepatic carcinoma and 20Healthy controls.ResultsThe proportions of Bregs among patients with liver cirrhosis and the ones with Hepatic carcinoma were significantly higher than those of the Healthy controls（29.90±9.19%vs 22.50±6.52%，P＝0.016vs P＝0.003），and no significant difference was observed between the proportions among the patients with liver cirrhosis and with Hepatic carcinoma（P＞0.05）.ConclusionThe proportions of Bregs among patients with liver cirrhosis and Hepatic carcinoma were obviously higher than that of healthy controls which indicates that the increase of Bregs may relate to the regulatory disorders of B lymphocytes in the patients with liver cirrhosis and Hepatic carcinoma.

regulatory B cells；Hepatitis B；liver cirrhosis；primary liver cancer；flow cytometry

R735.7

：A

孫健（1969－），男，副主任技師，主要從事臨床檢驗實驗及研究工作。

2013－07－17）

1007－4287（2014）12－1975－04

＊通訊作者