406例肺癌小活檢標本中表皮生長因子受體基因的突變分析

陳 劍，張 燕，王 華，葉菊香，裴 斐，張 波

406例肺癌小活檢標本中表皮生長因子受體基因的突變分析

陳 劍，張 燕，王 華＊，葉菊香，裴 斐，張 波

（北京大學醫學部病理學系／北京大學第三醫院病理科，北京100191）

目的探討肺癌小活檢標本中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的突變情況。方法采用蝎形探針擴增阻滯突變系統（Scorpions ARMS）檢測406例肺癌小活檢標本中EGFR基因第18、19、20和21外顯子的突變情況。結果在406例肺癌小活檢標本中，檢測到190例存在EGFR突變（占46.8%），其中80例為第19外顯子框內多核苷酸缺失、88例為第21外顯子L858R突變、4例為第21外顯子L861Q突變、9例為第18外顯子G719X突變、2例為第20外顯子S768I突變、1例為第20外顯子T790M突變；此外，發現6例存在雙位點突變。肺腺癌EGFR突變率為55.5%（186／335），鱗狀細胞癌突變率為5.8%（3／52），5例腺鱗癌中有1例檢測到EGFR基因突變，其它類型肺癌均未檢測到EGFR基因突變（0／14）。女性患者EGFR基因突變率（62.4%）明顯高于男性患者（32.1%，P＜0.01），非吸煙患者EGFR基因突變率（59.8%）明顯高于吸煙患者（24.7%，P＜0.01）。結論EGFR基因突變多見于女性、非吸煙和肺腺癌患者；Scorpions ARMS是檢測活檢小標本EGFR基因突變的可靠方法。

肺腫瘤；表皮生長因子；受體；基因突變；小活檢標本

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1944）

目前，肺癌的發病率和死亡率仍然高居榜首，分子靶向治療開始成為部分肺癌患者重要的治療手段［1］；其中，針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變而設計的酪氨酸激酶抑制劑（TKI）已開始在臨床應用［2］。及時為臨床提供腫瘤組織EGFR基因突變狀況以指導靶向治療成為當前肺癌分子檢測的重要任務［3］；但是約70－85%的新發肺癌是無法進行手術切除的晚期病例，這就意味著只能用穿刺組織或細胞學等小活檢標本進行診斷或做進一步檢測。對于腫瘤細胞較少的標本來說，需要選擇靈敏度高、特異性強、簡單快速的檢測方法。我們運用蝎形探針擴增阻滯突變系統（scorpions amplification refractory muta－tion system，Scorpions ARMS）檢測了406例肺癌患者穿刺組織、支氣管鏡活檢組織以及胸水沉渣標本中EGFR基因突變情況，并對如何提高小活檢標本基因檢測的質量做了介紹。

1 材料與方法

1.1臨床資料

收集北京大學第三醫院2012年6月至2014年2月間確診為原發性肺癌的小活檢標本406例。其中CT引導下經皮肺穿刺353例、支氣管鏡活檢26例、胸水沉渣標本13例、淋巴結穿刺組織5例、骨穿組織9例。男性209例，女性197例。年齡15歲至84歲，中位年齡63歲。組織學類型：腺癌335例、鱗狀細胞癌52例、腺鱗癌5例、大細胞癌5例、小細胞癌3例、非小細胞肺癌（非特指類型）5例、類癌1例。所有標本均為治療前獲取，經4%中性甲醛固定、石蠟包埋。

1.2DNA抽提

從石蠟包埋組織中切取5－8μm厚切片10片置于1.5ml離心管中，切片時每例之間用75%酒精將切片刀消毒以防止交叉污染。所有標本均同時切一張HE染色切片，用于判斷組織中腫瘤細胞含量。采用QIAamp DNA FFPE Tissue（QIAGEN公司）試劑盒提取組織DNA，操作步驟按說明書進行。提取的DNA經NANODROP超微量分光光度計測定濃度。

1.3ARMS法檢測EGFR基因突變

采用QIAGEN公司的EGFR RGQ PCR檢測試劑盒。按操作規程檢測EGFR基因4個外顯子中的29種突變；包括第18外顯子中G719X的3種點突變，第19外顯子中的19種缺失突變，第20外顯子中T790M、S7681點突變以及3種插入突變，第21外顯子中L858R、L861Q點突變。總反應體系為25μl，其中含探針緩沖液19.5μl、Taq酶0.5 μl、模板DNA 5μl。使用QIAGEN公司RGQ PCR儀進行檢測。PCR反應條件如下：95℃預變性15 min；95℃變性30s、60℃退火1min，循環40次。每批反應均同時設置陽性和陰性對照。反應結束后，通過熒光信號曲線及閾值線來判讀突變結果。

1.4統計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。用χ2檢驗和Fisher精確概率檢驗比較不同組別EGFR基因突變情況的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1ARMS法檢測肺癌小活檢標本中EGFR基因突變情況

406例肺癌小活檢標本中，共檢測到190例存在EGFR基因突變，突變率為46.8%；其中80例出現第19外顯子框內多核苷酸缺失（占所有突變的42.1%，圖1）、88例為第21外顯子L858R突變（46.3%，圖2）、4例為第21外顯子L861Q突變（2.1%）、9例為第18外顯子G719X突變（4.7%）、2例為第20外顯子S768I突變（1.1%）、1例為第20外顯子T790M突變。第19外顯子與第21外顯子單一突變占所有突變的90.5%，而第18外顯子與第20外顯子單一突變占所有突變的6.3%。此外，6例出現雙位點突變，其中3例為第19外顯子缺失和第20外顯子T790M突變（圖3）、3例為第18外顯子G719X和第20外顯子S768I突變。

圖1 第19外顯子框內缺失突變

圖2 第21外顯子點突變（L858R）

圖3 第19外顯子缺失和第20外顯子T790M雙位點突變

經皮肺穿刺組織353例，檢測到166例存在EGFR突變，檢出率為47%；支氣管鏡活檢組織26例，檢測到9例存在EGFR突變，檢出率為34.6%；胸水沉渣組織13例，有8例出現EGFR突變，占61.5%；淋巴結穿刺組織5例，其中2例檢出EGFR突變（40%）；骨穿組織9例，有5例檢出EGFR突變（55.6%）。

2.2EGFR基因突變與肺癌臨床病理指標之間的相關性（表1）

本組病例EGFR基因突變檢測結果顯示女性患者EGFR基因突變率為62.4%（123／197），明顯高于男性患者（32.1%，67／209）；非吸煙患者EGFR基因突變率（59.8%，153／256）明顯高于吸煙患者（24.7%，37／150），差異具有統計學意義。組織學類型中，335例肺腺癌中檢測到EGFR突變的有186例、占55.5%，52例鱗狀細胞癌中EGFR突變者3例、占5.8%，5例腺鱗癌中有1例檢測到EGFR基因突變，其它類型肺癌均未檢測到EGFR基因突變（0／14）。腺癌患者EGFR基因突變率明顯高于單純鱗狀細胞癌和其它類型肺癌（P＜0.01）。EGFR基因突變與患者年齡無明顯相關性。

表1 EGFR基因突變情況與臨床病理特點的關系［例數（%）］

3 討論

肺癌的分子靶向治療已逐漸為大家所熟知；小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）對于有EGFR基因突變的肺癌患者具有較高的客觀緩解率和生存質量［4］。因此，國內外有關臨床指南的診治中已明確指出，部分非小細胞肺癌（NSCLC）患者在作出診斷時就應進行EGFR基因突變檢測［5，6］。

人EGFR基因位于第7號染色體p13－q22區，全長200kb，由28個外顯子組成；編碼1186個氨基酸，糖蛋白分子量約170kDa。EGFR是一種重要的跨膜受體，具有酪氨酸激酶（TK）活性。人類許多惡性腫瘤如NSCLC、結直腸癌、頭頸部腫瘤、胰腺癌、乳腺癌等都存在EGFR的突變或異常表達，所引起的信號傳導失控與這些腫瘤的發生、發展密切相關。研究表明：EGFR突變與肺癌病理類型有關，在腺癌患者中突變發生率相對較高；最常見的是EGFR第19外顯子缺失和第21外顯子點突變（約占85%－90%），第18、20外顯子突變率約占10%［7，8］。EGFR基因突變的NSCLC患者，應用小分子酪氨酸激酶抑制劑（Gefitini－吉非替尼，Erlotinib－厄洛替尼）治療的有效率可達70%－80%。因此，對于NSCLC標本進行EGFR基因檢測能夠很好地指導臨床靶向治療［9］。

CT引導下經皮肺穿刺或支氣管鏡活檢等技術，由于微創、操作簡便、并發癥少等優勢，已越來越廣泛應用于臨床。多數晚期NSCLC患者難以進行手術治療，肺穿刺活檢是明確診斷的一個重要手段。因此，能夠用于分子檢測的標本多為小活檢標本。與手術切除標本相比，小活檢標本中所含腫瘤細胞比例較低，腫瘤細胞分布較分散，難以人工富集細胞。在小活檢標本中檢測基因突變，需要采用更為靈敏精準的方法。相關研究顯示，傳統的直接測序法靈敏度有限，腫瘤組織的突變含量需要達到20%以上才能被檢出［10］，而以實時熒光定量PCR法為基礎的擴增阻滯突變系統（amplification refractory mutation system，ARMS）則具有較高的敏感性和特異性［11］。

蝎形探針擴增阻滯突變系統（Scorpions ARMS）是將ARMS和Scorpions PCR兩種技術結合起來的一種新技術［12］。Scorpions探針由一條發夾結構的探針和一條引物構成，探針的5′端和3′端分別標記報告熒光和淬滅熒光，擴增過程中發夾結構打開，兩種熒光信號分離，即可檢測到報告熒光信號。由于序列特異性引物和探針在同一分子上，因此信號產生較快，可以檢測出樣品中含量低至1%的突變基因，具有靈敏度高、特異性強的特點，并且操作流程簡單、快速，整個過程無需反復開蓋，也無產物的后續處理，可以最大程度地避免擴增產物之間的交叉污染和環境污染。樣品在檢測的同時還設置了陽性及陰性對照，有效地避免了假陽性和假陰性，保證了結果判斷的準確性和可靠性，尤其適用于穿刺、細胞學等腫瘤細胞較少的標本。

研究表明，女性、非吸煙、腺癌及亞洲人群肺癌患者EGFR的突變率較高［13－15］。我們運用Scorpions ARMS檢測了406例原發性肺癌患者小活檢標本中EGFR基因突變情況，共檢測到190例中存在EGFR突變，檢出率為46.8%；其中90%以上突變發生在第19和21外顯子。本組研究還發現了6例雙位點突變，其中3例為第19外顯子缺失和第20外顯子T790M突變，后者是導致腫瘤對吉非替尼繼發耐藥的原因之一。本組病例檢測結果也顯示女性患者的EGFR基因突變率高于男性患者；非吸煙患者的EGFR基因突變率為59.8%，高于吸煙患者（24.7%）；肺腺癌EGFR突變率為55.5%，明顯高于鱗狀細胞癌（5.8%）；其它類型肺癌中未檢測到EGFR基因突變。說明ARMS法檢測活檢小標本EGFR基因突變具有特異性強、靈敏度高等優點，對于臨床部分肺癌的分子靶向治療具有重要指導作用。

由于小活檢標本體積小、組織疏松、質軟易碎，處理不當易使組織收縮、變脆、影響后續觀察和檢測；因此，我們對小活檢標本固定、脫水、浸蠟等過程的時間及所用試劑的濃度進行了嚴格控制。主要控制措施是：①選用4%中性緩沖甲醛固定，固定時間短于2小時；②逐級常溫脫水，在無水乙醇中停置時間不能過長，否則組織變硬變脆；③浸蠟包埋時溫度不可過高。小活檢標本除常規制備HE切片外，還須進行免疫組化染色，能夠用于基因檢測的組織較少。我們采用了預留免疫組化和基因檢測切片（或蠟卷）的方法，即做HE切片時，對于臨床懷疑肺癌的小活檢標本，我們一并切出6－8張免疫組化白片和8－10張蠟卷作為分子檢測備用；這樣可以避免二次切片時，因修塊而導致組織過少；同時將最后一張白片再染一張HE切片，以評估腫瘤細胞的含量和比例，使DNA提取的成功率明顯提高。

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Analysis of epidermal growth factor receptor gene mutations in 406 small biopsy samples of lung cancer

CHEN Jian，ZHANG Yan，WANG Hua，et al.
（Department of Pathology，Peking University Health Science Center／Peking University Third Hospital，Beijing100191，China）

ObjectiveTo investigate the mutations of epidermal growth factor receptor（EGFR）gene in small biopsy samples of lung cancer.MethodsMutations of EGFR gene（exons18，19，20and 21）in small biopsy specimens from 406cases of lung cancer were detected by scorpions amplification refractory mutation system（Scorpions ARMS）.ResultsEGFR gene mutations were identified in 190of 406（46.8%）small biopsy samples of lung cancer.In－frame deletions of exon 19occurred in 80patients and point mutation occurred at codon 858，861（exon 21）in 88and 4patients respectively.Nine patients had mutation at codon 719x（exon18）.Two patients had point mutation occurring at codon 768（exon 20）and one patient had point mutation occurring at codon 790（exon 20）.In addition，six patients had compound mutations.Mutations were present in 55.5%of 335adenocarcinoma and in 5.8%of 52squamous carcinoma.EGFR mutation was found in 1of 5adenosquamous carcinoma.There were no EGFR mutation in other type of lung cancer（0／14）.EGFR mutation rate was higher in female patients and patients without smoking history than male patients and patients with smoking history（P＜0.01，respectively）.ConclusionEGFR mutations were more common in female，nonsmoking patients with adenocarcinoma histology.Scorpions ARMS assay is a reliable，specifical and sensitive method for the detection of EGFR kinase domain mutations in small biopsy samples.

lung neoplasms；epidermal growth factor；receptor；gene mutation；small biopsy samples

R734.2

：A

2014－05－20）

1007－4287（2014）12－1944－04

國家自然科學基金項目（81272945）

＊通訊作者