熒光原位雜交技術檢測非小細胞肺癌EGFR基因狀態及與VEGF、D2－40、Ki－67表達相關性臨床意義研究

韓 影，刁文卓，陳 萍，程 薇

熒光原位雜交技術檢測非小細胞肺癌EGFR基因狀態及與VEGF、D2－40、Ki－67表達相關性臨床意義研究

韓 影1，刁文卓2，陳 萍1，程 薇1

（1.吉林市中心醫院病理科，吉林吉林132011；2.吉林市中心醫院神經外科）

肺癌是嚴重危害人類生命安全的最常見的惡性腫瘤之一，其中以非小細胞癌居多，近年來其發病率和死亡率呈明顯上升趨勢。雖然近年來在診斷方法和治療手段上有了很大發展，但是仍然不能得到滿意的治療效果，尋找有效的治療手段一直是腫瘤學界研究的方向。近年來出現的新的治療方法，即靶向治療，使個體化成為可能，明顯提高了腫瘤治療的療效。在肺癌靶向治療中，兩種小分子酪氨酸激酶抑制劑（即Iressa和Tarceva）能特異地抑制具有EGFR基因變異的非小細胞肺癌（NSCLC）癌細胞的生長，使病人的預后能夠得到改善。本研究通過熒光原位雜交技術對非小細胞癌EGFR基因狀態進行檢測，同時通過免疫組化染色檢測VEGF、D2－40、Ki－67的表達情況，進一步對兩者之間的相關性進行研究，從而為臨床診斷和治療提供有效的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料收集我院2008－2012年間病理科診斷為肺非小細胞癌的存檔蠟塊80例，年齡34－75歲，中位年齡55歲。其中男性45例，女性35例，所有病例均按照國際抗癌聯盟UIC的診斷標準進行病理分期，其中鱗癌26例，腺癌54例，以高分化21例、中分化36例和低分化23例進行分組，取其中20例癌旁正常組織作為對照組，術前均未進行放療和化療。

1.2方法

1.2.1 主要試劑EGFR基因擴增檢測試劑盒購自北京金菩嘉醫療科技有限公司。VEGF鼠抗人單克隆抗體、D2－40鼠抗人單克隆抗體、Ki－67鼠抗人單克隆抗體，SP染色試劑盒和DAB試劑均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2.2 主要儀器 熒光顯微鏡，免疫組化配套儀器，石蠟切片機，電熱恒溫干燥箱，光學顯微鏡。

1.2.3 EGFR雜交 確診為肺非小細胞癌的肺組織石蠟包埋樣本，切片厚度2.5μm，固定時間8－24 h之間，操作流程均按照說明書進行操作。

1.2.4 免疫組化染色 所有切片均為2.5μm厚連續切片，取一組行HE染色，再行SP免疫組化法檢測VEGF、D2－40和Ki－67三項指標。

1.2.5 結果判定 EGFR檢測結果計數100個細胞，統計ratio值，若ratio＜2為陰性結果，提示該樣本無EGFR基因擴增，若ratio值＞2為陽性結果，提示樣本中EGFR基因發生擴增。采用半定量雙盲法，根據顯微鏡下免疫組化陽性細胞染色進行評價，VEGF陽性反應為細胞膜或細胞漿呈棕褐色，D2－40陽性反應為細胞質和細胞膜呈棕褐色，Ki－67陽性反應為細胞核呈棕褐色、顆粒狀。每張切片隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，陽性細胞數≥50%為強陽性（＋＋＋），49%－25%為陽性（＋＋），25%－5%為弱陽性（＋），＜5%為陰性（－）。

1.2.6 統計方法 所得數據采用平均值±標準誤（MEAN±SE），采用Graph Pad Instat5.0統計軟件進行數據分析，多組間用單因素方差分析，兩組間比較采用Student’s t檢驗。認為P＜0.05差別有統計學意義。

2 結果

2.1EGFR在肺非小細胞癌中的表達研究表明若ratio值＞2為EGFR陽性，提示樣本中EGFR基因發生擴增。我們的研究結果為，低分化組的陽性率明顯高于中分化與高分化組（P＜0.01，n＝21－36），但是高分化與中分化之間沒有明顯差異。說明EGFR的陽性表達與非小細胞肺癌的惡性程度呈正相關，可以作為腫瘤分化不良的標志物，其表達高的腫瘤細胞可能具有更強的增殖能力（表1）。

2.2VEGF在肺非細胞癌中的表達VEGF免疫組化陽性反應為細胞膜或細胞漿呈棕褐色，我們的結果顯示高分化組與中分化組和低分化組之間具有明顯差異（P＜0.001，n＝21－36），中分化組與低分化組之間也有很大差異（P＜0.05，n＝21－36）。以上結果表明VEGF的陽性表達與非小細胞肺癌的惡性程度呈正相關，其惡性程度越高陽性率越高（表2）。

2.3D2－40在肺非小細胞癌中的表達D2－40陽性反應為細胞質和細胞膜呈棕褐色，我們的結果顯示在非小細胞肺癌組織內有陽性表達D2－40在高分化組與中分化組和低分化組之間具有明顯差異（P＜0.001，n＝21－36），但是中分化與低分化組之間沒有差異，說明隨著惡性程度升高D2－40表達陽性增強（表2）。

2.4Ki－67在肺小細胞癌中的表達Ki－67陽性反應為細胞核呈棕褐色、顆粒狀，我們的結果顯示非小細胞肺癌與癌旁正常肺組織中均有Ki－67增殖抗原表達。Ki67蛋白在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，并且高分化組的陽性率明顯低于中分化和低分化組（P＜0.001，n＝21－36），中分化又低于低分化組（P＜0.05，n＝21－36）（表2）。

2.5EGFR與VEGF、D2－40和Ki－67之間的關系我們的研究表明VEGF、D2－40和Ki－67在低分化組均高表達，說明三者隨著腫瘤的惡性度增加而增加，且EGFR與腫瘤的惡性度相關，說明EGFR與VEGF、D2－40和Ki－67這四者的表達可能存在某種關系，可以指導臨床肺非小細胞癌的診斷和治療。

表1 EGFR在不同病理學分級中的表達

表2 肺非小細胞癌在不同病理學分級中的表達

3 討論

隨著科技的發展，醫療水平的進步，肺癌的治療手段也有了一定的改進，但是由于空氣污染、吸煙等多種問題，肺癌的發病率也呈逐年上升趨勢。其中非小細胞型肺癌約占所有肺癌的85%－90%，所以近年非小細胞肺癌成為研究的焦點，以期找到更為有效的早期臨床診斷方法和治療手段，從而延長患者生命并提高其生活質量［1］。

3.1 表皮生長因子受體EGFR是一種受體酪氨酸激酶，原癌基因c－erbB1的表達產物。EGFR廣泛分布于人體中，對細胞的增殖分化有重要調控作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關信號通路中關鍵因子的活性或細胞定位異常，均會引起腫瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的發生［2］。已經有大量研究表明，EGFR基因與多種惡性腫瘤的發生和發展有密切關系，其表達水平的升高可以促進細胞的異型增殖，造成惡性腫瘤的發生，并且其表達水平的高低與腫瘤的程度具有相關性［3］。目前臨床資料表明EGFR抑制劑Erbitux（cetaximab，西妥昔）單抗抗腫瘤藥物可以結合腫瘤細胞EGFR位點，抑制腫瘤細胞增殖旁路，抑制腫瘤生長并促使其凋亡［4］。本實驗表明EGFR的陽性表達與非小細胞肺癌的惡性程度呈正相關，可以作為腫瘤分化不良的標志物，其表達高的腫瘤細胞可能具有更強的增殖能力。因此，EGFR可以作為非小細胞肺癌惡性程度的生物學指標，也可以作為判斷預后的重要參數。

3.2 在腫瘤的發生和發展過程中，血管的生成起到重要作用，任何種類的腫瘤都需要血液來提供氧氣和營養支持，VEGF在血管的生成過程中起到重要作用，其在多種腫瘤的發生、發展以及轉移中發揮著重要作用。有研究顯示，抗VEGF抗體的應用，可以明顯抑制腫瘤的［5］。本實驗研究結果顯示VEGF的陽性表達與腫瘤的惡性程度呈正相關，惡性程度高的低分化腫瘤細胞內表達較高，惡性程度低的中、高分化腫瘤細胞內表達相對較低，同時本實驗還觀察到，不但腫瘤細胞胞漿內有棕黃色染色，新生血管旁也有較強染色，這些現象說明VEGF是一種重要的血管生長因子，說明VEGF在非小細胞肺癌的腫瘤發生過程總起到重要作用。

3.3 D2－40首次是作為淋巴管內皮細胞特異性標記物應用于腫瘤淋巴管形成的研究，其表達于淋巴管內皮細胞內，但是并在血管內皮細胞無表達，因此其有助于淋巴管內皮細胞源性腫瘤診斷以及判斷其

他腫瘤組織是否發生淋巴道浸潤和轉移，研究表明其密度越高，轉移機會越大，預后越差［6］。隨著研究不斷深入，人們發現D2－40在多種腫瘤病理中還具有一些重要的診斷價值。目前發現98%睪丸精原細胞瘤彌漫性強陽性表達D2－40，同時其在雪旺氏瘤、富于細胞性神經鞘瘤和約75%上皮樣惡性周圍神經鞘膜腫瘤中呈彌漫性強陽性表達，D2－40作為一種免疫試劑可表達于多種類型細胞和不同類型腫瘤［7］。本研究結果顯示D2－40在非小細胞肺癌組織內有陽性表達，并且隨惡性程度升高表達陽性增強，這些現象說明D2－40可以作為非小細胞肺癌的標志物，并且可以作為判斷臨床預后的參數之一。

3.4 Ki－67是存在于增殖細胞核的一種非組蛋白核蛋白，其在除了G0期以外的其余細胞增殖周期內均有表達，并且在有絲分裂后蛋白含量迅速減少，新型抗體MB－1可以識別G1、S、G2、M期的Ki－67抗原表達，所以MB－1可以反映細胞群體增殖活性的客觀指標［8］。因此，本研究試圖通過檢測Ki－67在肺癌組織中表達，判斷其與腫瘤的惡性生物學特性的相關性。結果顯示：非小細胞肺癌與癌旁正常肺組織中均有Ki－67增殖抗原表達，Ki67蛋白在腫瘤組織中的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，說明Ki－67增殖抗原能間接反映惡性腫瘤的無限增殖活性。

3.5 本實驗研究發現EGFR的表達與非小細胞肺癌的分級有統計學意義（P＜0.01），表明EGFR可作為反映非小細胞肺癌增殖能力的重要指標，在促進非小細胞肺癌的發生發展中起到重要作用。有研究顯示VEGF可以將EGFR的刺激導入細胞內，導致細胞持續增殖，最終形成腫瘤［9］。本實驗研究發現在低分化的非小細胞肺癌腫瘤組織中VEGF與EGFR的表達均明顯升高，在中分化和高分化中兩者的表達均相對較低，這種一致的表達水平表明兩者在非小細胞肺癌的表達中存在正相關性，兩者可能在非小細胞肺癌的發生發展過程中存在協同作用，通過這種協同作用，進一步擴大兩者對細胞增殖長生的影響，從而更加促進了腫瘤的發展。這實驗同時研究了D2－40和Ki－67在非小細胞肺癌內的表達，發現他們的表達水平均與EGFR的表達一致，即在低分化腫瘤中表達高，在中、高分化腫瘤中表達較低，也存在正相關性，這表明他們可能也與EGFR在非小細胞肺癌的發生和發展過程中起到了協同作用，但這種協同作用的機制有待進一步研究。

人的非小細胞肺癌的發生是一個多因素參與的復雜過程，其中EGFR、VEGF、D2－40、Ki－67的表達起著重要作用，它們都與腫瘤的發生有著密不可分的關系，并且它們的表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關。同時本研究發現，EGFR與VEGF、D2－40、Ki－67的表達具有相關性，表明這三者在腫瘤的發生過程中具有彼此協同的作用。這四個指標可以作為臨床檢測非小細胞肺癌的重要標志物，可以結合臨床參數，指導治療，評價預后。同時控制這四種指標在腫瘤中的表達，也可以作為非小細胞肺癌臨床治療的新思路。

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2013－12－09）

1007－4287（2014）12－1926－03

吉林市科技局科技計劃項目（201133146）