白藜蘆醇對同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈內皮細胞NO、eNOS和小凹蛋白表達影響

張 麗，李 林，李愛歆，高 山＊

白藜蘆醇對同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈內皮細胞NO、eNOS和小凹蛋白表達影響

張 麗1，李 林2，李愛歆1，高 山1＊

（1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154002；2.吉林大學中日聯誼醫院）

血管內皮細胞氧化應激損傷和功能的異常是動脈粥樣硬化（AS）發生的核心環節。內皮細胞產生的NO具有擴張血管的作用，同時，通過抑制血小板的聚集、白細胞的粘附、減少氧自由基的產生等起到抗AS作用。內皮型一氧化氮合酶（eNOS）是NO產生的關鍵酶。當細胞受到外界信號刺激時，eNOS與小凹蛋白（CAV1）分離，eNOS被激活，從而產生NO。流行病學調查發現白藜蘆醇（Res）具有潛在的抗AS作用，但其作用機制尚不明確。CAV1是PI3k／Akt上游靶點［1］，是調節eNOS的負性因子，因此，我們推測Res可通過抑制CAV1的表達，從而上調eNOS的表達。

本研究通過同型半胱氨酸（Hcy）誘導內皮細胞損傷的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）模型，觀察不同濃度下的Res對CAV1和NO系統的變化。

1 材料與方法

1.1主要試劑臍帶、DMEM培養基、MTT、兔抗人CAV1多克隆抗體、兔抗人eNOS多克隆抗體、Trizol、TaKaRa RNA PCR試劑盒、硝酸還原酶法試劑盒、western blotting試劑盒等。

1.2主要儀器96孔培養板、PCR儀、紫外分光光度計、酶聯免疫檢測儀、紫外光譜分析儀、熒光分光光度計等。

1.3HUVEC的培養取佳木斯大學附屬第一醫院健康孕婦，正常分娩胎兒的新鮮臍帶，采用膠原酶消化分離內皮細胞，接種細胞于含20%小牛血清的DMEM培養基中，在37℃、5%CO2的培養箱內靜置培養，細胞傳2－3代用于實驗。

1.4Hcy損傷模型的構造及細胞活力的檢測將處于對數生長期的內皮細胞消化計數接種于96孔板。待細胞長到次融合狀態（80%）時，用M－199無血清培養液替換原培養液，繼續培養24、48h。用0、0.1、0.25、0.5、1mmol／L濃度的Hcy處理細胞，每個濃度設6個復孔，繼續培養24、48h后，每孔加入20μl的MTT，37℃繼續培養4h后，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150μl，震蕩15分鐘，在490 nm波長下，用酶聯免疫檢測儀每孔的吸光度值。

1.5實驗分組及細胞液的收集重復上述步驟至用M－199無血清培養液替換原培養液后，加入0、0.1、0.5、1、10μmol／L濃度的Res，除空白對照組外，其余各組均加入1mmol／L濃度的Hcy，培養24 h。

1.6NO濃度的檢測將不同組別的細胞培養液按照硝酸還原酶法試劑盒說明書進行測定，測定NO濃度。

1.7eNOS和CAV1蛋白的測定根據western blotting試劑盒的說明書進行eNOS和CAV1蛋白的測定，蛋白條帶采用Image Lab軟件自動分析。

1.8eNOS和CAV1mRNA的測定不同組別的細胞培按照TaKaRa RNA PCR試劑盒說明書進行細胞總RNA的提取與逆轉錄cDNA。取2μl的cDNA進行Real－time PCR，反應體系為25μl。eNOS上游引物為5′－ACCCTAGAATGGAGAGCAT－3′，下游引物5′－GCCTGCACTGTCTGTGCCA－3′。CAV1上游引物為5′－CCTCTACAAGCTCAACAACATG－3′，下游引物為5′－CACATCTTCAGAGTCAATCTGG－3′，內參β－actin上游引物為5′－AGCGACACAGTGCTGGAC－3′，下游引物為5′－ACAAGCAATGATCTTGATGAC－3′。

1.9統計方法實驗數據采用均數加減標準差（x—±s）表示，利用SPSS 19.0統計軟件處理。多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗，探討NO系統和CAV1的相關性，采用Pearson線性相關。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1Hcy損傷HUVEC適宜濃度的確定96孔板內加入0、0.1、0.25、0.5、1mmol／L的Hcy，培養24、48h后，通過MTT法測定HUVEC增殖活性。培養24和48h，隨著Hcy濃度的增加，HUVEC增殖活性可劑量依賴性地降低（P＜0.01）。同時48h的Hcy損傷組的細胞增殖活性低于24h各組（P＜0.01）。故本次實驗采用1mmol／L的Hcy作為損傷HUVEC模型的濃度，同時培養時間定為24h（表1）。

表1 不同濃度的Hcy對HUVEC增殖活性（OD490nm）的影響（x—±s）

2.2 不同組別NO濃度比較 Hcy損傷組的NO含量低于空白對照組；加入Res后，NO含量逐漸上升，0.1和1μmol／L的Res組的NO含量升高幅度最大。加入不同濃度的Res各組的NO含量均高于Hcy損傷組（P＜0.01），見表2。

表2 Res對Hcy致HUVEC損傷的NO濃度的影響（x—±s）

2.3不同組別eNOS和CAV1蛋白的比較Hcy損傷組的eNOS蛋白含量低于空白對照組；加入不同濃度的Res后，eNOS蛋白含量升高，0.1μmol／L組升高幅度最大。Res各組的eNOS蛋白含量均高于Hcy損傷組（P＜0.01）。

Hcy損傷組的CAV1蛋白含量高于空白對照組；Res濃度為1μmol／L時，CAV1蛋白含量降低的幅度最大。加入Res各組的CAV1蛋白含量均低于Hcy損傷組（P＜0.01）。（見表3，圖1）。

表3 Res對Hcy致HUVEC損傷的eNOS蛋白和CAV1蛋白的影響（x—±s）

圖1 Res對Hcy致HUVEC損傷的eNOS蛋白和CAV1蛋白的影響

2.4不同組別eNOS和CAV1 mRNA的比較Hcy損傷組的eNOS mRNA含量顯著下降；加入0.1μmol／L Res后，eNOS的mRNA含量升高幅度最大。加入Res各組的eNOS的mRNA含量均高于Hcy損傷組（P＜0.01）。

Hcy損傷組的CAV 1的mRNA含量高于空白對照組；Res濃度為1μmol／L時，CAV 1的mRNA降低的幅度最大。加入Res各組的CAV 1mRNA含量均低于Hcy損傷組（P＜0.01）。（見表4，圖2）

表4 Res對Hcy致HUVEC損傷的eNOS和CAV1 mRNA的影響（x—±s）

2.5NO系統與CAV1的相關性NO與CAV1蛋白及CAV1的mRNA呈負相關（P＜0.05）；eNOS蛋白與CAV1蛋白具呈負相關（P＜0.001）；eNOS的mRNA表達量與CAV1的mRNA表達量呈負相關（P＜0.001）。（見表5）

圖2 Res對Hcy致HUVEC損傷的eNOS和CAV1 mRNA的影響

表5 Res組內NO、eNOS和CAV1蛋白及mRNA的相關性分析

3 討論

抑制內皮細胞功能紊亂已成為防治AS的關鍵環節之一。內皮細胞合成的NO產生的異常可導致血管內皮細胞功能紊亂，同時NO濃度的下降不僅使血管舒張異常，而且其抗血小板聚集、抗平滑肌增殖作用減弱，可加速AS的進程。Drab M等［2］通過敲除小鼠CAV1基因后，證明CAV1可抑制eNOS的活性。CAV1與eNOS結合后，通過Rac1／Akt信號通道抑制eNOS的活性，減少NO的產生，從而導致AS。Res具有潛在的抗AS作用。可通過增加超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽及其還原酶等細胞保護因子，增強機體抗氧自由基防御系統，通過對高膽固醇血癥家兔模型的研究，RSV通過抑制ox－LDL的形成，抑制血小板的聚集和平滑肌增殖。Res可以通過減少脂質堆積、抗氧化和抗炎癥因子等作用抑制血管內皮細胞的功能紊亂，從而減緩AS的進程。

Hcy隨著劑量和時間的增加，HUVEC增殖活性逐漸降低。郝寶順等［3］研究證實Hcy對HUVEC增殖活性的影響具有劑量依賴性。故本研究選擇1mmol／L的Hcy，培養24h建立HUVEC氧化應激損傷模型進行實驗探討。國內張海洋［4］等研究表明，Hcy損傷模型組的NO濃度、eNOS的mRNA含量及蛋白表達均顯著低于空白對照組，這與我們的研究結果一致。我們的研究發現，加入不同濃度的Res后，能逆轉Hcy對HUVEC的損傷。不同濃度下的Res組，NO濃度、eNOS的mRNA及蛋白表達含量具有劑量依賴關系。當Res濃度為0.1μmol／L時，NO濃度、eNOS的mRNA及蛋白表達含量升高的幅度最大。當Res的濃度達到10 μmol／L時，NO含量、eNOS的mRNA及蛋白表達量升高幅度減少。Res濃度在0.01－1μmol／L范圍時，CAV1的mRNA和蛋白含量隨著表達逐漸下降，當Res濃度為1μmol／L時，CAV1的mRNA和蛋白表達含量下降幅度最大，但當Res濃度為10 μmol／L時，CAV1的mRNA和蛋白表達含量卻出現上升趨勢。在Res組中進行NO系統與CAV1的相關性發現，NO、eNOS與CAV1具有負相關。

Thomas WP等［5］研究表明，Res能上調HUVEC中eNOS的mRNA的水平，且隨著時間的延長和濃度增加，eNOS的mRNA水平也增加。Takizawa Y等［6］采用1μmol／L濃度的Res連續6天作用于HUVEC中，證實eNOS的表達水平上調。

我們的研究結果表明，Res抗AS的作用，其機制與抑制CAV1的mRNA和蛋白表達，上調eNOS表達，促進NO的釋放有關。

［1］van den Heuvel AP，Schulze A，Burgering BM.Direct control of caveolin－1expression by FOXO transcription factors［J］.Biochem J，2005，385（Pt 3）：795.

［2］Drab M，Verkade P，Elger M，et al.Loss of caveolae，vascular dysfunction，and pulmonary defects in caveolin－1gene－disrupted mice［J］.Science，2001，293（5539）：2449.

［3］郝寶順，余舒杰，劉 勇，等.瑞舒伐他汀對同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈內皮細胞超＼氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2013，21（9）：802.

［4］張海洋，張會敏.Hcy對臍靜脈內皮細胞eNOS和caveolin－1表達影響［J］.中國公共衛生，2012，28（5）：642.

［5］Wallerath T，Deckert G，Ternes T，et al.Resveratrol，apolyphenolic phytoalexin present in red wine，enhances expression and activity of endothelial nitric oxide synthase［J］.Circulation，2002，106（13）：1652.

［6］Takizawa Y，Kosuge Y，Awaji H，et al.Up－regulation of endothelial nitric oxide synthase（eNOS），silent mating type information regulation 2homologue 1（SIRT1）and autophagy－related genes by repeated treatments with resveratrol in human umbilical vein endothelial cells［J］.Br J Nutr，2013，110（12）：2150.

2014－05－17）

1007－4287（2014）12－1923－03

黑龍江省自然科學基金面上項目（D201210）

＊通訊作者