腸源性高草酸尿大鼠模型的建立

陳清江，李 遜，雷 鳴，何永忠

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510700；2.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院海印微創(chuàng)外科中心，廣東 廣州 510120)

腸源性高草酸尿大鼠模型的建立

陳清江1，李 遜1，雷 鳴2，何永忠1

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510700；2.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院海印微創(chuàng)外科中心，廣東 廣州 510120)

目的建立腸源性高草酸尿的大鼠模型。方法隨機選取30只雌性SD大鼠置于大鼠代謝籠中適應性喂養(yǎng)7 d之后收集24 h尿，記錄尿量，采用離子色譜儀測定其草酸濃度，計算正常大鼠在該條件下24 h尿草酸排泄量。菠菜汁灌胃處理大鼠，再測定灌胃后24 h尿草酸排泄量。對比灌胃菠菜汁前后，大鼠24 h尿草酸排泄量的差別；分組對照實驗，隨機選取20只雌性SD大鼠，隨機分成A組和B組，B組灌胃菠菜汁，A組灌胃等量純凈水，其他條件相同，比較兩組24 h尿草酸排泄量。結(jié)果反復測定，正常大鼠灌胃菠菜汁前24 h尿草酸排泄量為(0.53±0.18)mg，灌胃菠菜汁后第1天為(1.93±0.36)mg，第3天為(1.85±0.38)mg，第7天為(2.03±0.39)mg；A組(0.44±0.12)mg，B組(1.68±0.38)mg。結(jié)論大鼠在灌胃菠菜汁之后其尿液24 h草酸排泄量明顯增加，大概增加3～4倍，說明每天對大鼠進行定量定濃度的菠菜汁灌胃，可以使其保持長期的高草酸尿狀態(tài)，該方法建立的腸源性高草酸尿大鼠模型簡便可行，可廣泛用于其他方面的研究。

腸源性高草酸尿；尿；大鼠模型；離子相色譜

我國泌尿系結(jié)石的人群患病率為2%～5%[1]。泌尿系結(jié)石是泌尿外科的常見病多發(fā)病，因此，如何預防泌尿系結(jié)石已日益成為人們關(guān)心的問題。我國是世界上泌尿系結(jié)石三大高發(fā)區(qū)之一，大部分尿路結(jié)石為草酸鈣結(jié)石，而高草酸尿是其重要的成石因素。本實驗擬從大鼠日常飲食中添加外源性高草酸食物(菠菜)，構(gòu)建腸源性高草酸尿癥的動物模型，旨在探討通過飲食控制能否控制尿液草酸濃度，降低尿路結(jié)石成石因素，從而起到預防尿路結(jié)石的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 菠菜購自超市，自然完整狀態(tài)下洗凈晾干，用水果榨汁機榨成菠菜汁，密封保存于4℃。

1.2 儀器和試劑 實驗儀器：離子色譜儀792 Basic IC(瑞士萬通公司)，其操作方式通過792 BasicIC 1.0軟件控制和估算。大鼠代謝籠(廣州飛迪科技有限公司)。試劑配制：淋洗液：分別稱取5.007 4 g的Na2CO3和0.294 0 g的NaHCO3加去離子水至2 L，配制成濃度為17.5 mmol/L的Na2CO3和3.5 mmol/L的NaHCO3；再生液：4 ml濃H2SO4加去離子水配制成濃度為50 mmol/L。取二水草酸(C2H2O4·2H2O)0.143 2 g加去離子水100 ml配制成濃度為1 mg/ml的標準儲備液，可4℃保存1周，再配制100 mg/L的工作液。

1.3 實驗動物 50只SD大鼠(雌性，SPF級)，體重在200～220 g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK(粵)2008-0002]。

1.4 實驗方法

1.4.1 自身灌胃前后對照 隨機選取30只SD大鼠置于大鼠代謝籠中，標準顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲用自來水，適應性喂養(yǎng)7 d之后收集第1天的24 h尿，記錄尿量，取0.1 ml尿液，用去離子水滴定至5 ml，再通過0.2 μm的微孔濾膜過濾后注入離子色譜儀，檢測尿中草酸濃度，計算大鼠24 h尿草酸排泄量；同法計算第3 d大鼠24 h尿草酸排泄量，統(tǒng)計出正常大鼠24 h尿草酸排泄量；實驗過程中若有大鼠日飲水量低于10 ml，收集尿液低于4 ml，則將其從實驗中剔除。

1.4.2 菠菜汁灌胃前后對照 市場購入新鮮菠菜，洗凈晾干，采用水果榨汁機將其榨成菠菜汁，取菠菜汁0.1 ml加入去離子水稀釋至5 ml，通過0.2 μm的微孔濾膜后注入離子色譜儀，計算菠菜汁濃度，大概5～6 mg/ml，以100 mg/(kg·d)的菠菜汁草酸濃度對實驗大鼠進行灌胃處理。分別于灌胃第1、3、7天收集大鼠24 h尿，同法檢測24 h尿液草酸排泄量。與灌胃前的24 h尿草酸排泄量形成比較。

1.4.3 隨機分組對照 隨機選取20只SD大鼠，隨機分為A組和B組，每組10只，B組按之前的方法灌胃菠菜汁，A組灌胃等量的純凈水，置于代謝籠中收集24 h尿液，計算尿量，離子色譜儀檢測尿液草酸濃度，其他實驗條件一致。每次收集24 h尿的前一天記錄大鼠的體重(g)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差()表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 草酸標準曲線的繪制 取100 mg/L的工作液，用去離子水稀釋至1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L，分別注入離子色譜儀進樣孔，在6.18 min出現(xiàn)草酸峰，經(jīng)過792 Basic IC 1.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，自行繪制標準曲線。草酸在1～20 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，RSD=1.106%，曲線相關(guān)系數(shù)r=0.999 91，偏移值(截距)為0.685 33，斜率為2.711 43，回歸直線方程Y=2.711 43X+0.685 33，靈敏度達0.04 mg/ml，同時取工作液，分別稀釋至0.25 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L，發(fā)現(xiàn)其在0～1 mg/L范圍內(nèi)也有良好的線性關(guān)系。草酸回收實驗結(jié)果見表1。

表1 草酸回收實驗結(jié)果

2.2 大鼠體重 實驗各組大鼠的體重均逐漸增加，灌胃前與灌胃后1 d分組對照實驗組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)

2.3 大鼠24 h尿量 無論是自身對照還是分組對照實驗，各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)

2.4 24 h尿草酸排泄量 灌胃后各組與灌胃前比較，24 h尿草酸排泄量明顯增加，但灌胃后三組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2、表3。

注：與灌胃前比較，aP＜0.05。

表3 分組對照實驗24 h尿草酸排泄量的比較()

表3 分組對照實驗24 h尿草酸排泄量的比較()

注：B組與A組比較，P＜0.05，大概升高3～4倍。

組別A組(n=10) B組(n=10)尿草酸排泄量(mg/24 h，) 0.44±0.12 1.68±0.38

3 討 論

在臨床上，尿路結(jié)石成分分析顯示出82%左右是草酸鈣結(jié)石[2]，在草酸鈣結(jié)石的成石因素中，尿液中高草酸這一因素占據(jù)著主導地位，腎小管上皮細胞損傷是結(jié)石形成的必備條件，而尿液高草酸濃度能對腎小管上皮細胞產(chǎn)生細胞毒作用，通過抗氧化自由基作用而損傷腎小管上皮細胞，促進結(jié)晶的粘附[3-4]。高草酸尿癥在臨床上分為：特發(fā)性高草酸尿、腸源性高草酸尿和原發(fā)性高草酸尿。原發(fā)性高草酸尿是由于肝臟缺乏AGT和DGDH或者功能異常導致的，特發(fā)性高草酸尿表現(xiàn)出一定的家族遺傳性，可由具有明顯高草酸尿癥的近交系大鼠傳代培養(yǎng)獲得[5]，而腸源性高草酸尿癥則有慢性腸病、短腸綜合征等病因誘發(fā)，想要獲取其動物模型較難。本實驗基于在飲食中添加外源性草酸，使其腸內(nèi)游離草酸增多，進而增加了外源性草酸的吸收，最終增加了尿草酸的排泄量[6-7]，從而獲得高草酸尿癥的動物模型。本文重點在于研究泌尿系結(jié)石的成石因素，研究表明，高草酸尿是草酸鈣結(jié)石最危險的成石因素，高草酸尿?qū)Σ菟徕}過飽和的影響是其他影響因素的10倍[8]；本實驗選取菠菜作為外源性高草酸的飲食來源，因其作為人們喜愛的蔬菜，一直以營養(yǎng)價值高而備受歡迎，此外其獲取途徑簡便快捷、經(jīng)濟易操作，同時菠菜是一種大家熟悉的富含草酸的食物，高草酸對于人體來說是一種抗營養(yǎng)因子，長期食用可增加尿液草酸排泄量，引起泌尿系結(jié)石[9-11]，是否增加飲食中草酸的含量，就會增加尿液草酸的排泄量？是否穩(wěn)定？這些就是本實驗所要解決的問題。

實驗中采取飲食中添加菠菜的方法，來達到高草酸尿癥的效果。菠菜取材簡便，草酸含量高，是人們?nèi)粘ｏ嬍持休^為常見的蔬菜，也廣為大眾喜愛，以該方法構(gòu)建高草酸尿癥的動物模型，是本實驗的創(chuàng)新點之一。由于以前缺乏精確檢測草酸的方法和儀器，難以對尿液草酸，食物中草酸的含量進行檢測，也就難以從這些方面構(gòu)建高草酸尿癥的動物模型。然而本實驗采用離子色譜法[12]檢測草酸含量，可以解決這個問題，其精度可以達到0.5 μm/L，操作過程簡便，快捷，樣本處理簡單，適用于大規(guī)模檢測草酸，能滿足該實驗大規(guī)模篩選測定草酸含量的需要，是一種先進的檢測技術(shù)。該方法具有方便快捷、操作簡便、所需尿量少、結(jié)果準確等優(yōu)點。而本實驗中的標準曲線、重復性實驗、回收率實驗等也證實了這一點。傳統(tǒng)的變色酸比色法檢測尿液草酸需要水浴濃硫酸，對工作人員和環(huán)境有影響，且實驗時間長，草酸需要1～2 d，難以滿足大規(guī)模樣本的測定，而本實驗的離子色譜法，測定一個樣本的時間只需要6～8 min。

先進的大鼠代謝籠，其設計特點使得大鼠的尿液和糞便得以分離，在經(jīng)過實驗方法改良之后，能完全將尿液和糞便隔離，從而保證能夠準確的收集到大鼠24 h尿液且無糞便污染，這些設計得以保證大鼠24 h尿液草酸排泄量測定的可靠性。

大鼠飲食中，對標準顆粒飼料所含的草酸進行檢測，使得顆粒飼料中的草酸含量穩(wěn)定，從而保證其測定結(jié)果具有可比性。控制單一變量，添加菠菜汁與否。在以上的條件下進行試驗，其結(jié)果不添加菠菜飲食的大鼠24 h尿草酸為(0.53±0.18)mg，添加菠菜飲食的大鼠24 h尿草酸為(1.85±0.38)mg。飲食中添加菠菜的大鼠中尿草酸比不添加菠菜的大鼠要高出3～4倍，且進行持續(xù)性的灌胃菠菜汁處理，觀察7 d、1個月，其尿液草酸含量基本穩(wěn)定在一個較高的范圍內(nèi)(1.35～2.68)mg/24 h。如果停止灌胃菠菜汁，一般于第三天其尿草酸可以降到正常范圍。提示該腸源性高草酸尿的大鼠模型需要持續(xù)性給予高草酸飲食才能達到維持建模效果。由于菠菜汁獲取途徑簡便，灌胃操作簡單，本腸源性高草酸尿的大鼠模型的構(gòu)建還是很成功的，可以廣泛用于其他方面的研究，提供動物模型。本動物模型的構(gòu)建成功，也為后續(xù)比較乳雙歧桿菌和產(chǎn)甲酸草酸桿菌降低尿草酸能力的比較提供可靠的動物模型。

本實驗成功構(gòu)建了大鼠的腸源性高草酸尿癥動物模型，驗證了飲食中如果長期高草酸飲食可以引起尿草酸增加的現(xiàn)象，從而指導日常飲食，但長期的尿液高草酸狀態(tài)是否就會引起泌尿系結(jié)石仍值得進一步探討。

綜上所述，通過控制大鼠外源性草酸的攝入量，可以在大鼠體內(nèi)成功建立“腸源性高草酸尿癥”動物模型。結(jié)合該實驗模型，針對我國素食習慣為主人群，對于預防草酸鈣結(jié)石和防止結(jié)石復發(fā)起著重要的指導作用。

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Establishment of rats model with enterogenous hyperoxaluria.

CHEN Qing-jiang1,LI Xun1,LEI Ming2,HE Yong-zhong1.
1.Department of Urology Surgery,the Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medicine University, Guangzhou 510700,Ghuangdong,CHINA;2.Haiyin Minimally Invasive Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medicine University,Guangzhou 510120,Ghuangdong,CHINA

ObjectiveTo establish enterogenous hyperoxaluria model in rats.MethodsThirty randomly selected female Sprague-Daw-ley rats were fed in individual metabolic cage for 7 days.24 h urine oxalate excretions were examined by ion chromotagraphy before and after the spinach juice lavage,and the difference was investigated. Another 20 female Sprague-Daw-ley rats were randomly divided into group A and group B.Group B was lavaged with spinach juice and group A was lavaged with equivalent pure water.24 h urine oxalate excretions of group A and group B were compared.ResultsThe 24 h urine oxalate excretion was(0.53±0.18)mg before lavaging spinach juice.On first day,third day and seventh day after lavaging spinach juice,the 24 h urine oxalate excretions were(1.93±0.36)mg, (1.85±0.38)mg,and(2.03±0.39)mg，respectively.The 24 h urine oxalate excretion of group A and group B were (0.44±0.12)mg and(1.68±0.38)mg,respectively.Conclusion The 24 h urine oxalate excretion of SD rats was markedly increased 3 to 4 times after lavaged with spinach juice.Daily lavage with quantitatively and constant concentration spinach juice can maintain long-term high oxalic acid urine state in rats.This method of establishing enterogenous hyperoxaluria model in rats is simple and feasible,which can be widely used.

Enterogenous hyperoxaluria;Urine;Rats model;Ion chromotagraphy

R-332

A

1003—6350（2014）14—2036—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.14.0792

2014-01-20)