高效液相色譜法測定槐米中槲皮素的含量

趙虎平

（包頭醫學院第一附屬醫院藥劑科，內蒙古 包頭 014010）

高效液相色譜法測定槐米中槲皮素的含量

趙虎平

（包頭醫學院第一附屬醫院藥劑科，內蒙古 包頭 014010）

目的 建立槐米中槲皮素的含量測定方法。方法 利用甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，v/v）檢測波長375 nm，其中甲醇為色譜純，磷酸為分析純，流速為0.8 mL/min。色譜柱：Diamonsil(TM)C18(416 mm×250 mm，5 μm)。結果 槲皮素在1.964～19.64 mg/mL的濃度范圍內峰面積和濃度呈良好的線性關系r=0.9994；測得回收率為98.6%，RSD為1.8%。結論 方法準確可靠、簡便，適用于槐米中槲皮素的含量測定。

槐米；槲皮素；高效液相色譜法；含量測定

槐米是豆科植物槐（Sophora japonicaL）的干燥花蕾或花，具有清肝瀉火的功能[1]。其主要成分為黃酮類，與槐花的藥理作用密切相關。因此，槐花的質量主要由黃酮類的含量決定。黃酮類中的黃酮苷主要包括蘆丁及槲皮素等。槲皮素（Quercetin）是黃酮醇的一種代表性化合物，具有很高的藥用價值，能夠抗氧化、清除氧自由基、降低血壓、保護心肌缺血再灌注損傷等[2]。可據此利用槲皮素制作中藥制劑，并進行提取。本研究采用加熱回流法，對槲皮素進行提取，并建立針對其的HPLC測定方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀（日本島津，LC-10Tvp）；紫外-可見檢測器（SPD-10Avp）；雙通道色譜工作站N-2000（浙江大學智能信息工程研究所，浙江大學智能信息工程有限公司）；BS110S電子天平（北京塞多利斯天平有限公司Max為110 g，d=0.1 mg）；KQ-50型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；0.45 μm微孔濾膜；水浴回流裝置；容量瓶等。

1.2 試劑

槐米，槲皮素標準品；甲醇（色譜純），甲醇（分析純）；水為重蒸餾水；磷酸為分析純，25%鹽酸。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil（TM）C18（416 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，v/v）；檢測波長：375 nm；流速：0.8 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮素對照品0.001 g，于100 mL量瓶中加適量甲醇溶解、定容配成10 μg/mL的溶液100 mL，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取槐米適量，用研缽研磨，過100目篩得本品粉末。取本品粉末0.12 g，加甲醇-25%鹽酸（4∶1）混合溶液水浴回流30 min，放冷，置于50 mL的量瓶中，加甲醇使其稀釋至刻度，搖勻即可。

2.4 標準曲線的制作

取槲皮素對照品5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇（色譜純），超聲處理20 min后過濾，加甲醇（色譜純）定容到刻度，備用。精密量取上述對照品溶液0.20、0.25、1.20、2.00 mL，分別置4個10mL量瓶中，加甲醇（色譜純）稀釋至刻度，搖勻。分別量取20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖。以濃度（C μg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線形回歸，得回歸方程：Y=107.02X+7616.8。相關系數r=0.9994。表明：在1.964～19.64 mg/mL的濃度范圍內，槲皮素的峰面積和濃度呈現良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取對照品溶液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇（色譜純）稀釋至刻度，超聲處理后20 μL進樣，重復5次，記錄峰面積，計算主峰面積的相對標準偏差，其中五次的值分別為134076.031，133516.383，129512.398，137479.516，143425.297，RSD為0.69%。

2.6 重現性試驗

取樣品粉末0.12 g，進行精密稱定后，按上述制備方法和測定條件，重復測定5份。記錄峰面積分別為35141.293，32630.783，34890.906，32856.066，36646.836，RSD為0.26%。

2.7 回收率試驗

取樣品粉末0.12 g，進行精密稱定后，按上述供試品溶液的制備方法和測定條件，重復測定6份。測定結果如表1。測得回收率為98.6%，RSD為1.8%。

3 結果與討論

3.1 結果

取適量槐米，研磨，過100目篩，約0.12 mg粉末，精密稱定后加甲醇-25%鹽酸（4∶1）混合溶液25 mL，水浴回流30 min以使其冷卻，置50 mL量瓶中精密吸取1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇，超聲處理20 min使完全溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測得4批（n=3）樣品中槲皮素的含量分別為：12.46%（RSD=0.75%）；9.78%（RSD=1.0%）；9.43%（RSD=0.64%）；11.09%（RSD=0.38%）。

3.2 討論

3.2.1 檢測波長的選擇

取適量的槲皮素對照品，以甲醇為溶劑，在紫外可見分光光度計上，于200～600 nm掃描。結果顯示，槲皮素在264 nm、375 nm波長處，吸收量最大。在同一條件下經高效液相色譜儀測定，槲皮素的峰面積在375 nm處較264 nm波長處大，因此，選擇375 nm作為槲皮素的檢測波長。

3.2.2 流動相的選擇

調整流動相甲醇-0.4%磷酸溶液的比例（50∶50，55∶45，60∶40，70∶30）20 μL進樣，記錄色譜圖如圖1。確定二者比例在60∶40時分離效果最好，而且靈敏度較高。

圖1 對照品（甲醇-0.4%磷酸溶液=60∶40，v/v）時的色譜圖

3.2.3 溶液水解條件的選擇

鹽酸水解蘆丁為槲皮素，而槲皮素易溶于甲醇，因此，蘆丁的水解和槲皮素的提取受到不同比例、體積的甲醇-25%鹽酸混合溶液的影響[3]。在本研究中，研究者對水解時混合溶液的比例和體積進行了選擇，水浴回流30 min，放冷，置50 mL量瓶中精密吸取1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇進行超聲處理，使其完全溶解并稀釋至刻度，搖勻、濾過后，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果表明在甲醇-25%鹽酸總體積為25 mL比例為4∶1時，水解條件最佳結果為甲醇-25%鹽酸總體積為25 mL比例為4∶1[4]。取蘆丁對照品同法水解，經過薄層色譜法和高效液相色譜法的測定，如圖2所示，蘆丁已完全水解為槲皮素。

圖2 供試品（甲醇-25%鹽酸總體積為25 mL比例為4∶1）色譜圖

[1] 李力更,李作平,霍長虹.固相萃取-分光光度法聯用測定中藥槐米中蘆丁含量的研究[J].中成藥,2003,25(8):673-674.

[2] 李云峰.槲皮素代謝的研究進展[M].生理科學進展,2002,33(1): 53-55.

[3] Hosseini MS,Belador F.Cr (III)/Cr (VI) speciation determination of chromium in water samples by luminescence quenching of quercetin[J].J Hazard Materials,2009,165(1):1062-1067.

[4] Olszewska M.Separation of quercetin,sexangularetin,kaempferol and isorhamnetin for simultaneous HPLC determination of flavonoid aglycones in inflorescences,leaves and fruits of three Sorbus species[J].J Pharm and Biomed Anal,2008,48(3): 629-635.

R446；R9

B

1671-8194（2014）18-0094-02