黃芪注射液對人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成的干預(yù)作用

李琳琳申緋翡馬雷雷李亞東*

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2 洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽 471000；3 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029)

黃芪注射液對人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成的干預(yù)作用

李琳琳1申緋翡2馬雷雷1李亞東3*

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2 洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽 471000；3 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029)

目的 觀察黃芪注射液對體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞增生以及細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響。方法 用0～400 mg/mL濃度的黃芪注射液作用于體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞，24～72 h后觀察不同濃度的黃芪注射液對成纖維細(xì)胞增殖活性及其功能的影響。MTT法觀察成纖維細(xì)胞的生長活性，天狼猩紅染色觀察膠原生成情況。結(jié)果 與對照組相比，在25～200 mg/mL濃度作用下，黃芪注射液對成纖維細(xì)胞的生長具有促進(jìn)作用；在400 mg/mL濃度作用下，黃芪注射液能夠明顯抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖。結(jié)論 黃芪注射液在高濃度條件下抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的生長，中低濃度下促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，呈現(xiàn)劑量依賴性。

黃芪注射液；人胚肺成纖維細(xì)胞；細(xì)胞外基質(zhì)

肺纖維化的形成與肺組織反復(fù)損傷后的過度修復(fù)有關(guān)，表現(xiàn)為肺ECM合成與降解穩(wěn)態(tài)失衡，尤其是膠原代謝失衡[1]。在病理改變方面以成纖維細(xì)胞增殖及大量ECM沉積為特征[2]。因此，尋找有效藥物抑制肺成纖維細(xì)胞的過渡增生是防治肺纖維化的重要手段之一。《神農(nóng)本草經(jīng)》載黃芪，性微溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)，有補氣升陽，益衛(wèi)固表，托毒生肌，利水退腫之功效。黃芪用途廣泛，可用于脾肺氣虛或中氣下陷之癥，衛(wèi)氣虛所致表虛自汗，氣血不足所致癰疽不潰或潰久不斂，浮腫尿少，氣虛血滯所導(dǎo)致的肢體麻木、關(guān)節(jié)痹痛和氣虛津虧的消渴等癥。現(xiàn)代藥理研究表明黃芪的主要化學(xué)成分有黃芪多糖、皂苷類、黃酮類和氨基酸等。本實驗主要觀察黃芪注射液對體外培養(yǎng)條件下的人胚肺成纖維細(xì)胞的生長增殖和膠原合成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）購置中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心；MEM/NEAA培養(yǎng)液購置中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；胰酶購于Sigma公司；胎牛血清購于Gibco公司；黃芪注射液購置成都地奧九泓制藥廠，每支10 mL（相當(dāng)于原生藥材20 g）；0.1%天狼猩紅苦味酸染液購置北京海德生物科技有限公司；噻唑藍(lán)（MTT），二甲基亞砜（DMSO）購置北京科海軍舟有限公司；熒光倒置顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱，SANYO公司；酶標(biāo)儀，為美國B.D公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM/NEAA培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的CO2育箱中培養(yǎng)，96 h長滿瓶底，3～4 d更換1次培養(yǎng)液，傳代。

1.3 黃芪注射液對MRC-5增生的影響

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的MRC-5，胰酶37 ℃消化5 min，以10%胎牛血清的MEM/NEAA培養(yǎng)液制備成1×105/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)液板中，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞長至單層后，分別在細(xì)胞中加入不同濃度的藥物培養(yǎng)液，同時設(shè)不加藥的陰性對照和只加培養(yǎng)液的空白對照，每組設(shè)10個復(fù)孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入200 μL DMSO，輕微震蕩10 min，使MTT完全溶解，于自動酶標(biāo)儀490 nm波長處測定各孔吸光度A值。

1.4 膠原的檢測[3]

取對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞，用MEM/NEAA培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/mL，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，37 ℃、5% CO2及飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后在各組細(xì)胞中加入含有不同濃度的藥物培養(yǎng)液，另設(shè)不加藥的正常對照組，每組設(shè)10個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加甲醇100 μL，-20 ℃固定一夜，PBS洗1次，天狼猩紅染1 h，0.1%醋酸洗3次，每孔加入0.1 μmol/L NaOH 20 μL，室溫震蕩1 h，置于酶標(biāo)儀540 nm處檢測。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪注射液對體外培養(yǎng)人胚肺MRC-5細(xì)胞增殖的影響

見表1。MTT結(jié)果：黃芪注射液濃度為400 mg/mL時能顯著抑制MRC-5生長（P＜0.05）。25～200 mg/mL的濃度范圍對MRC-5的生長具有促進(jìn)作用。說明黃芪注射液對人胚肺成纖維細(xì)胞的生長增殖既可促進(jìn)又可以抑制，呈劑量依賴性。

表1 黃芪注射液對體外培養(yǎng) MRC-5細(xì)胞生長的影響()

表1 黃芪注射液對體外培養(yǎng) MRC-5細(xì)胞生長的影響()

注：與對照組相比較，P＜0.05

組別 劑量 A值24 h 48 h 72 h對照組 0 0.259±0.01 0.476±0.03 0.575±0.05實驗組 25 0.275±0.03 0.524±0.02 0.675±0.02實驗組 50 0.294±0.02 0.534±0.04 0.739±0.02實驗組 100 0.325±0.02 0.554±0.03 0.745±0.03實驗組 200 0.305±0.10 0.515±0.03 0.599±0.01實驗組 400 0.236±0.05 0.355±0.01 0.373±0.02

2.2 鏡下觀察成纖維細(xì)胞形態(tài)的變化

對照組的細(xì)胞密度低時，細(xì)胞長梭形或三角形，有多個細(xì)胞質(zhì)突起（圖1）；細(xì)胞密度高時，以長梭形為主，排列緊密，呈放射狀或渦旋狀，邊界不清（圖2）。用藥組的細(xì)胞：25～200 mg/mL濃度下的細(xì)胞形態(tài)與對照組差別不大，僅生長速度快于對照組；400 mg/mL濃度下的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞邊緣變鈍，細(xì)胞間隙增寬，分布松散，甚至可以看到漂浮的死亡細(xì)胞（圖3）。

2.3 膠原測定結(jié)果

隨著黃芪注射液的濃度增加，與對照組相比，當(dāng)濃度在25～200 mg/mL時，成纖維細(xì)胞的膠原生成量有所增加，而在400 mg/mL濃度時，成纖維細(xì)胞的膠原生成量明顯減少。結(jié)果見表2。

圖1 對照組細(xì)胞低密度照片

圖2 對照組細(xì)胞高密度照片

圖3 400 mg/mL濃度下細(xì)胞照片

表2 不同濃度的黃芪注射液對體外培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞的ECM影響()

表2 不同濃度的黃芪注射液對體外培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞的ECM影響()

注：與對照組相比較，P＜0.05

組別 劑量（mg/mL） 吸光度對照組 0 0.403±0.018黃芪注射液組 25 0.426±0.054黃芪注射液組 50 0.434±0.047黃芪注射液組 100 0.505±0.032黃芪注射液組 200 0.436±0.047黃芪注射液組 400 0.242±0.016

3 討 論

肺纖維化是多種原因引起的慢性肺系疾病的共同結(jié)局，是多種肺系疾病發(fā)展到晚期的共同病理變化。其集中表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積。在肺部，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一膠原即來自于活化的成纖維細(xì)胞。由于成纖維細(xì)胞的異常增殖及膠原的分泌增加在肺纖維化過程中起著重要作用[4]，因此，抑制肺成纖維細(xì)胞增殖是防治肺纖維化的一種有效手段。

本實驗以人胚肺成纖維細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究黃芪注射液對成纖維細(xì)胞形態(tài)及膠原表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液在中低濃度條件下對成纖維細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，在高濃度條件下則有抑制作用。提示其可能有預(yù)防或延緩肺纖維化疾病進(jìn)程的作用。有研究表明，在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，Ⅰ、Ⅲ型膠原合成與降解失衡起主要作用，在肺泡炎癥階段或肺纖維化早期主要以Ⅲ型膠原增加為主，此期病變尚可逆轉(zhuǎn)，隨后病變轉(zhuǎn)為慢性，則以Ⅰ型膠原沉積為主，形成不可逆轉(zhuǎn)的改變[5,6]。天狼腥紅染液能與膠原緊密吸附，反應(yīng)極其穩(wěn)定，染色后不褪色，有特異性，是目前膠原染色最好的染料。在普通光鏡下觀察，膠原纖維呈紅色。

綜上所述，黃芪注射液在中低濃度下能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，高濃度下可以抑制成纖維細(xì)胞的生長，因此可以延緩肺纖維化的進(jìn)程。同時提示黃芪對人體的作用具有雙向性。

[1] ArauJo CC,Leon LL.Biological activities of Curcuma longal[J]. Meminst Oswald Cruz,2001,96(4):7232-7238.

[2] 陳珍旭,吳蓉易.葛根素對實驗性大鼠肺纖維化影響[J].臨床肺科雜志,2006,11(4):4232-4236.

[3] Brnton MH,Kopp JB.TGFβ-1 and Fibrosis[J].Microbes Infect,19 99,1(15):1349-1365.

[4] 趙洪文.肺成纖維細(xì)胞在肺纖維化中的作用[J].國外醫(yī)學(xué)·呼吸系統(tǒng)分冊,1996,16(3):116-117.

[5] 侯杰,戴令娟.川芎嗪、丹參治療大鼠肺纖維化對Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因表達(dá)的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,1999,22(1):43-44.

[6] 何玉先,劉秉慈.實驗性矽肺纖維化組織中Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因的表達(dá)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,1994,14(6):43-46.

R28

B

1671-8194（2014）18-0086-02

國家自然基金資助項目（項目編號：81202787）

*通訊作者：E-mail： lydtry@sina．com