黃芪注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷后JNK3基因表達(dá)的影響

李 艷 房 雷 黃 惠 王 嶺 孫 麗*

（青島大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)科，山東 青島 266043）

黃芪注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷后JNK3基因表達(dá)的影響

李 艷 房 雷 黃 惠 王 嶺 孫 麗*

（青島大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)科，山東 青島 266043）

目的 探討黃芪注射液對大鼠腦缺血/再灌注損傷后細(xì)胞凋亡和c-jun氨基末端激酶（JNK3）表達(dá)的影響。方法 應(yīng)用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立大鼠大腦中動脈阻塞再灌注（MCAO/R）模型，經(jīng)腹腔注射黃芪注射液（3 mL/kg）干預(yù)治療。Longa法評分標(biāo)準(zhǔn)評價大鼠神經(jīng)行為功能，流式細(xì)胞術(shù)檢測海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，Western blot檢測JNK3蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測JNK3 mRNA表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)黃芪注射液治療后，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元JNK3蛋白和JNK3 mRNA表達(dá)較對照組顯著減低，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而動物神經(jīng)行為功能顯著改善。結(jié)論 黃芪注射液可通過下調(diào)神經(jīng)元JNK3基因表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，改善動物的神經(jīng)行為功能。

腦缺血；再灌注損傷；黃芪注射液；JNK3；凋亡；大鼠

c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路是絲裂原活化蛋白激酶中的重要通路，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]。哺乳動物細(xì)胞編碼JNK的基因包括jnkl、jnk2和jnk3，其中jnk3編碼產(chǎn)物JNK3僅在腦、心臟、睪丸等組織表達(dá)[2]。因此，抑制JNK3基因表達(dá)是防治腦缺血損傷的重要措施之一[3]。實驗證實，許多中藥活性成分具有神經(jīng)保護(hù)作用[4]，卓名等[5]研究表明，黃芪注射液能減少腦缺血/再灌注后腦組織中細(xì)胞浸潤，減輕炎性反應(yīng)和腦水腫。葉冬青等[6]研究證實，黃芪注射液可抑制凋亡相關(guān)基因JNK3表達(dá)，但腦保護(hù)作用的機(jī)制還不十分清楚[7]。本實驗擬進(jìn)一步觀察黃芪注射液對腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡和JNK3表達(dá)的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型和分組

成年雄性Wistar大鼠35只（SPF級，體質(zhì)量230～250 g），由青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供（SCXK20090007）。動物置實驗室環(huán)境適應(yīng)7 d，自由飲食。隨機(jī)選擇10只為對照組，其余25只應(yīng)用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立MCAO/R模型[8]，缺血2 h后退出插線實現(xiàn)再灌注。對照組的手術(shù)步驟相同，但插線進(jìn)入頸內(nèi)動脈10 mm后即刻退出。動物蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner征，提尾右前肢內(nèi)收屈曲、爬行時向右側(cè)劃圈者為成功模型。將術(shù)后2 h死亡的5只動物剔除，成功的20只再隨機(jī)分為模型組和治療組各10只。

1.2 治療方案

黃芪注射液（國藥準(zhǔn)字Z31020084，成都地奧九泓制藥廠）。參照劉莎莎等[9]報道的劑量，治療組動物在造模成功后2 h，經(jīng)腹腔注射黃芪注射液3 mL/kg，24 h后再給藥1次。對照組和模型組同步給予等量生理鹽水。

1.3 評級指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)行為功能評分

末次給藥24 h后，所有動物（n=10）參照Longa評分標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行。無神經(jīng)功能缺損0分；不能完全伸直對側(cè)前爪1分；向右側(cè)轉(zhuǎn)圈2分；向右側(cè)傾倒3分；不能自己行走，意識喪失4分。評分越高表示行為功能損傷越嚴(yán)重。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

每組隨機(jī)選取5只動物以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，迅速剝離缺血側(cè)海馬區(qū)腦組織200 mg，-4 ℃冰浴中研磨成腦組織勻漿，收集細(xì)胞懸液，低溫保存。以Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司），用FACS can Calibuer （BD公司，USA）流式細(xì)胞檢測，于1 h內(nèi)分析凋亡百分比，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.3 Western blot檢測JNK3蛋白表達(dá)

每組隨機(jī)選取5只動物以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，迅速剝離缺血側(cè)海馬區(qū)腦組織200 mg，BCA法測定樣品總蛋白含量。取蛋白樣品50 μg，應(yīng)用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)膜（Bio-Rad，USA）。將膜置于X線片盒曝光4 min，顯影40 s，定影2 min，水洗5 min。Bio-Rad 2000型凝膠成像系統(tǒng)掃描光片，Quantity one軟件進(jìn)行吸光度分析。以同一標(biāo)本3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的吸光度值作為內(nèi)參照，校正目的蛋白的積分吸光度值（樣品吸光度值/GAPDH吸光度值），重復(fù)測定3次，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.4 RT-PCR檢測JNK3 mRNA

取上述腦組織100 mg，Trizol（Invitrogen，USA）一步法提取總RNA。紫外分光光度計（Beckman，USA）測定RNA純度。JNK3 PCR引物（F：5’-CTG ATG CAG TGC ACG ATC TAC -3’，R：5’-AGC GTC GTA CTA GAC GTT GCG AT-3’）和GAPDH內(nèi)參（F：5’-TAG TCT ACA TGC TGC AGT ACT ACT- 3’，R：5’-CGA CTT GAT GTT AGC GAG ATA TC -3’）由上海基康生物技術(shù)公司合成。Takara RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Stanta Cruz，USA）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖（Sigma，USA）凝膠電泳檢測。以目的基因JNK3與內(nèi)參GAPDH的吸光度比值為目的基因的相對含量。重復(fù)測定3次，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果采用SPSS15.0軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以（means ± SD）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)行為功能評分

對照組動物L(fēng)onga法評分0分，模型組動物L(fēng)onga法評分為（2.23± 0.45），治療組動物L(fēng)onga法評分為（1.55±0.35），較模型組顯著降低（t=5.06，P＜0.01）。

2.2 神經(jīng)元凋亡

Annexin V-FITC染法流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率（656±1.65）較對照組（1.67±0.35）明顯增高（t=8.20，P＜0.01）治療組神經(jīng)元凋亡率（4.35±1.12）較模型組明顯降低（t=3.13，P＜0.01）。

2.3 JNK3蛋白表達(dá)

Western blot法顯示，對照組JNK3蛋白形成較弱11 kD片段（0.326 ±0.081）；模型組JNK3蛋白表達(dá)（0.879±0.214）較對照組顯著增強(qiáng)（t=6.84，P＜0.01）；治療組JNK3蛋白表達(dá)（0.562±0.136）較模型組明顯降低（t=3.54，P＜0.01），見圖1。

圖1 Western blot法檢測JNK3蛋白表達(dá)

RT-PCR顯示，對照組JNK3 mRNA（197 bp）表達(dá)較弱（0.331± 0.065），模型組JNK3 mRNA表達(dá)（0.932±0.204）較對照組顯著增強(qiáng)（t=7.94，P＜0.01），治療組JNK3 mRNA表達(dá)（0.667±0.165）較模型組顯著減弱（t=2.85，P＜0.01），見圖2。

圖2 RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測JNK3 mRNA（左）和GAPDH（右）表達(dá)

3 討 論

腦缺血再灌注可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中凋亡相關(guān)基因JNK3表達(dá)與神經(jīng)元凋亡關(guān)系十分密切[10]。如何阻止這種遲發(fā)性神經(jīng)元死亡挽救缺血半暗帶成為目前治療的主要方向[11]。葉冬青[6]等研究表明，缺氧/復(fù)氧可增加JNK3表達(dá)而誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。腦缺血/再灌注損傷應(yīng)急刺激能激活JNK3使其迅速轉(zhuǎn)入胞核，再激活活化轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、Jun D，引起大量與凋亡有關(guān)的基因表達(dá)，誘導(dǎo)延遲性死亡[12]。黃芪甲苷是中藥黃芪中提取皂苷的主要成分，已有效應(yīng)用于心、腦、血管疾病和其他疾病的治療，作用與機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究[13]。本實驗結(jié)果表明，腦缺血后海馬區(qū)神經(jīng)元JNK3mRNA及其蛋白表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)元變性，大鼠表現(xiàn)為行為功能障礙。經(jīng)黃芪注射液敢于治療后，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元JNK3 mRNA及其蛋白表達(dá)顯著減弱，降低JNK3蛋白的活性，神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著減少，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能和動物神經(jīng)行為功能的修復(fù)，這與以往的報道[14]結(jié)果基本相符，進(jìn)一步提示，黃芪注射液可通過抑制JNK3的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，從而改善動物的神經(jīng)行為功能，有望為治療腦缺血/再灌注損傷提供新的方法和途徑。

[1] Davis RJ.Signal transduction by the JNK group of MAP kinases[J].Cell,2000,103(4):221-229.

[2] Bogoyevitch MA,Kobe B.Uses for JNK: the many and varied substrates of the c-Jun N-terminal kinases[J].Microbiol Mol Biol Rev,2006,70(4):1061-1095.

[3] O’Collins VE,Macleod MR.Experimental treatments in acute stroke[J].Ann Neurol,2006,59(3):467-477.

[4] Guo YL,Xu XY.Anti-inflammation effects of picrosideⅡ in cerebral ischemic injury rats[J].Behavioral Brain Function,2010, 6(1):43-53.

[5] 卓名,陳鴻蓮,蔡娜麗,等.黃芪注射液對新生兒缺氧缺血性腦病的臨床與免疫機(jī)制研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2008,15(1):13-15.

[6] 葉冬青,高維娟,錢濤,等.黃芪注射液抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元JNK3的表達(dá)[J].中國藥理學(xué)通報,2010,26(1):77-82.

[7] 曲友直,李敏,高國棟.黃芪注射液對大鼠腦缺血/再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2011,18(5):263-265.

[8] Longa EZ,Weinstein PR.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[9] 劉莎莎,高維娟,錢濤,等.黃芪注射液對腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK-3表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2012,28(5):665-670.

[10] Sun W,Gould TW.Phosphorylation of c-Jun in avian and mammalian motoneurons in vivo during apoptosis: An early reversible event in the apoptotic cascade[J].Neuroscience,2005, 25(23):5595-5603.

[11] Kanahal V,Scklichter LC.Mechanisms of microglia-mediated neurotoxicity in a new model of the stroke penumbra[J].J Neuro sci,2008,28(9):2221-2230.

[12] 王寧,薛瑞玲,姚法志,等.JNK3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報,2007,28(6):617-618.

[13] 朱燕輝,嚴(yán)奉祥.黃芪甲苷及其生物學(xué)活性[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,8(4):76-87.

[14] 張雅麗,高維娟,閆風(fēng)霞,等.黃芪注射液抑制缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究[J].中國老年學(xué)雜志,2009,29(7):793-796.

The Effect of Astragalus Injection on Apoptosis and Expression of JNK3 in Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats

LI Yan, FANG Lei, HUANG Hui, WANG Ling, SUN Li*
(Department of Neurology, the 2nd Affiliated Hospital, Qingdao University, Qingdao 266043, China)

Objective To study the effect of astragalus injection on neuronal apoptosis and expression of c-Jun N-terminal kinase3 (JNK3) in cerebral ischemia reperfusion injury in rats. Methods The middle cerebral artery occlusion reperfusion rat models were established by inserting a filament suture from left external-internal carotid artery, and treated by injecting intraperitoneally astragalus injection (3 mL/kg). The neurobehavioral function was evaluated by Longa’s test and the neuronal apoptosis in hippocampus detected by flow cytometry. The expressions of JNK3 mRNA and protein were respectively detected by western bloting and RT-PCR. Results After treated by astragalus injection, the expression of JNK3 mRNA and protein, the number of apoptotic neurons in hippocampus reduced significantly, while the neurobehavioral function of rats improved than those in model group. Conclusion Astragalus injection might improve the neurobehavioral function of rats by down-regulating the expressions of JNK3 and inhibiting neuronal apoptosis.

Cerebral ischemia; Reperfusion injury; Astragalus injection; JNK3; Apoptosis; Rats

R743.3；R-33

B

1671-8194（2014）18-0001-02

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（2011HW034）

*通訊作者：E-mail： 806451617@qq．com