丙型肝炎病毒對白細胞介素32表達影響的研究

祝成亮，李 艷，劉興暉，葉芳麗

(1.武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區公利醫院檢驗科，上海 200135；3.湖北醫藥學院附屬東風醫院檢驗科，湖北 十堰 442008)

丙型肝炎病毒對白細胞介素32表達影響的研究

祝成亮1，李 艷1，劉興暉2，3，葉芳麗1

(1.武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區公利醫院檢驗科，上海 200135；3.湖北醫藥學院附屬東風醫院檢驗科，湖北 十堰 442008)

目的 探討丙型肝炎病毒(HCV)在體內外對白細胞介素32(IL-32)表達的影響。方法 熒光定量PCR和免疫印跡法檢測Huh7.5.1細胞中IL-32 mRNA和蛋白的表達水平，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-32的血清含量。結果 HCV感染的Huh7.5.1細胞IL-32 mRNA和蛋白的表達水平較對照細胞高，HCV患者IL-32血清含量明顯高于健康對照(P＜0.05)。結論 HCV能夠在體內外促進IL-32的合成和分泌。

丙型肝炎病毒；白細胞介素32；酶聯免疫吸附試驗；表達

據世界衛生組織調查，目前全球有大約1.7億的人感染丙型肝炎病毒(HCV)，約有20%的HCV患者會在20年內發展成為肝硬化，一旦肝硬化形成，發展成為肝癌的進程為每年1%～4%，HCV肝損傷并非由病毒本身直接導致，而是由于病毒與機體免疫系統相互作用過程中導致正常肝組織產生纖維樣變引起。白細胞介素32(IL-32)是一種重要的炎癥因子，參與機體的炎癥反應。本研究主要通過體內外實驗探討HCV對IL-32表達的調節，為揭示HCV的致病機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集HCV感染的患者138例，其中男性75例，女性63例，平均年齡(45.3±13.4)歲，所有患者均排除其他肝病毒和細菌的感染。選取126例健康體檢者作為對照，其中男性67例，女性59例，平均年齡(42.7±12.5)歲。

1.2 材料 人肝癌細胞系Huh7.5.1及含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1細胞由本室保存[1]；IL-32 ELISA檢測試劑盒購自美國Rapidbio公司；IL-32多克隆抗體購自購自美國美國Abcam公司；TRIzol R試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄酶M-MLV購自美國Promega公司，熒光定量PCR采用美國LC480 PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 Huh7.5.1細胞用含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，在37℃恒溫箱中進行培養。

1.3.2 熒光定量PCR檢測 TRIzol R試劑提取Huh7.5.1細胞的RNA，逆轉錄成cDNA后，用IL-32基因的檢測引物5'-GAGACAGTGGCGGCTTAT-3' (上游)，5'-TCCTCAACATCCGGGACA-3'(下游)進行熒光定量PCR擴增，以β-actin為內參照。

1.3.3 Western blot檢測 裂解液裂解Huh7.5.1細胞，取30μg蛋白樣品加入上樣緩沖液后進行SDS-PAGE電泳分離,電泳結束后將蛋白轉到硝酸纖維素(NC)膜上，分別加入IL-32蛋白多克隆抗體和二抗，最后采用電化學發光(ECL)進行顯色。

1.3.4 EIISA的檢測 IL-32血清含量采用ELISA法進行檢測，方法參照試劑盒說明書。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差(±s)表示，HCV感染組和對照組IL-32血清含量的比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCV患者IL-32血清水平升高 我們收集了138例HCV患者和126例健康體檢者血清，采用ELISA檢測了IL-32的水平。結果顯示，HCV患者血清IL-32水平[(162.54±43.78)pg/ml]顯著的高于健康體檢者水平[(98.59±37.36)pg/ml，P＜0.05]。

2.2 HCV在細胞水平上調IL-32 mRNA和蛋白的表達 為探討HCV在細胞水平對IL-32表達的影響，我們采用熒光定量PCR和Western blot檢測了含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其對照細胞IL-32 mRNA和蛋白的表達情況。結果顯示，感染了HCV的Huh 7.5.1細胞IL-32 mRNA和蛋白的表達明顯升高。見圖1和圖2。

圖1 熒光定量PCR檢測IL-32 mRNA的表達

圖2 Western blot檢測IL-32蛋白的表達

3 討論

丙型肝炎病毒(HCV)是一種屬于黃病毒科家族的帶有包膜的RNA病毒，它包含一條長為9 600個堿基的正義單鏈RNA基因組。HCV感染能夠引起機體的炎癥反應，導致急慢性肝炎，最終發展為原發性肝癌(HCC)，HCV感染是HCC發生的主要原因之一。

白細胞介素32(IL-32)是一種新發現的細胞因子，參與機體的炎癥反應，其基因定位于16號染色體上，含有8個小外顯子，主要由免疫細胞表達，但在一些炎癥部位的組織中也有表達[2]。研究證實艾滋病患者和流感患者血清中IL-32的表達升高[3]，在乙型肝炎的研究中也發現，乙肝患者IL-32的血清水平也明顯升高[4]。

在本研究中，我們通過ELISA的方法檢測了HCV患者和健康對照者血清含量，結果發現HCV患者IL-32血清含量明顯高于健康對照，表明HCV能夠在體外上調IL-32的表達。目前一般認為HCV并非直接損傷肝細胞，而是由于機體炎癥反應所引起。HCV感染機體后導致一系列細胞因子表達的升高，包括白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素12(IL-12)、γ-干擾素(IFN-γ)等[4]。IL-32能夠誘導很多炎癥因子如白細胞介素1β(IL-1β)，IL-6，白細胞介素8(IL-8)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等的表達，進而引起機體的炎癥反應[5]。因此，HCV可能通過上調IL-32的表達來參與肝炎的發生和發展。

由于HCV主要感染肝細胞，我們采用熒光定量PCR和Western blot檢測了HCV病毒感染的肝癌細胞Huh7.5.1及其對照細胞IL-32表達的差異，發現HCV能夠在體內促進IL-32的表達。研究證實流感病毒和乙型肝炎病毒(HBV)通過激活CREB和NF-κ B通路誘導IL-32的轉錄[2，6]，但HCV通過何種信號通路調節IL-32的表達，是否也通過激活CREB和NF-κ B通路進行調節，尚待進一步研究。

[1]祝成亮,李 艷,葉芳麗,等.丙型肝炎病毒上調膠原三股螺旋重復蛋白1的表達[J].海南醫學,2013,24(17):2497-2498.

[2]Li W,Liu Y,Mukhtar MM,et al.Activation of interleukin-32 pro-inflammatory pathway in response to influenza A virus infection[J]. PLoS One,2008,3(4):e1985.

[3]Xu Q,Pan X,Shu X,et al.Increased interleukin-32 expression in chronic hepatitis B virus-infected liver[J].

[4]Jung MY,Son MH,Kim SH,et al.IL-32 gamma induces the maturation of dendritic cells with Th1-and Th17-polarizing ability through enhanced IL-12 and IL-6 production[J].J Immunol,2011, 186(12):6848-6859.

[5]Nold-Petry CA,Nold MF,Zepp JA,et al.IL-32-dependent effects of IL-1beta on endothelial cell functions[J].Proc Natl Acad Sci U SA,106(10):3883-3888.

[6]Pan X,Cao H,Lu J,et al.Interleukin-32 expression induced by hepatitis B virus protein X is mediated through activation of NF-κB [J].Mol Immunol,2011,48(12-13):1573-1577.

Study on the effect of Hepatitis C virus(HCV)on the expression of interleukin 32.

ZHU Cheng-liang1,LI Yan1, LIU Xing-hui2,3,Ye Fang-lil.1.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital,of Wuhan Universety,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Shanghai Pudong New Area Gongli Hospital,Shanghai, 200135,CHINA;3.Department of Clinical Laboratory,Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442008,Hubei,CHINA

Objective To explore the effect of hepatitis C virus(HCV)on the expression of interleukin 32 (IL-32).Methods The mRNA and protein expression of IL-32 in Huh7.5.1 cells were measured by real-time PCR and western blot.Serum levels of IL-32 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results Expression of IL-32 mRNA and protein was higher in Huh7.5.1 cells infected by HCV than in the control cells.Serum IL-32 levels was significantly higher in HCV patients as compared with healthy controls(P＜0.05).Conclusion HCV can upregulate the synthesis and secretion of IL-32 both in vivo and in vitro.

Hepatitis C virus;Interleukin 32;Enzyme-linked immunosorbent assay;Expression

R512.6+3

A

1003—6350（2014）18—2708—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1062

2014-03-31)

國家臨床重點專科專項經費(編號：2010305)；國家自然科學基金(編號：81101485)；湖北省教育廳科學技術研究項目(編號：D20122404)

李 艷。E-mail：yanlitf1120@163.com