鼻咽癌組織EBI3和p35蛋白的表達(dá)及臨床意義

劉 艷，曾今誠(chéng)，梁小泉

(1.佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 佛山 528200；2.廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，廣東 湛江 524023)

鼻咽癌組織EBI3和p35蛋白的表達(dá)及臨床意義

劉 艷1，曾今誠(chéng)2，梁小泉1

(1.佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 佛山 528200；2.廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，廣東 湛江 524023)

目的 檢測(cè)EBI3、p35在鼻咽癌(NPC)組織中的表達(dá)水平，分析EBI3和p35在NPC發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)50例NPC患者、30例癌旁黏膜和25例鼻咽黏膜慢性炎患者炎癥組織中EBI3和p35表達(dá)，并分析其與NPC患者臨床分期、病理組織類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果 NPC組織中EBI3高表達(dá)率為62.0%，顯著高于癌旁黏膜組織中的36.7%(χ2=4.83，P＜0.05)和鼻咽黏膜慢性炎患者炎癥組織中的36.0%(χ2=4.53，P＜0.05)。T3～T4期NPC患者中EBI3高表達(dá)率顯著高于T1～T2期患者(χ2=17.24，P＜0.01)；非角化型鱗癌NPC患者癌組織中EBI3高表達(dá)率顯著高于角化型鱗癌患者(χ2=8.78，P＜0.01)；有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者癌組織中EBI3高表達(dá)率顯著高于無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌患者(χ2=14.49，P＜0.01)。p35高表達(dá)率為60.0%，顯著高于癌旁黏膜組織中的33.3%(χ2=5.33，P＜0.05)和鼻咽黏膜慢性炎患者炎癥組織中的36.0%(χ2= 3.85，P＜0.05)。T3～T4期NPC患者中p35高表達(dá)率顯著高于T1～T2期患者(χ2=19.28，P＜0.01)；非角化型鱗癌NPC患者癌組織中p35高表達(dá)率顯著高于角化型鱗癌患者(χ2=7.24，P＜0.01)；有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者癌組織中p35高表達(dá)率顯著高于無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌患者(χ2=5.56，P＜0.05)。NPC組織中EBI3和p35表達(dá)之間呈正相關(guān)(r=0.328，P＜0.05)。結(jié)論 NPC組織中EBI3和p35高表達(dá)與鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，有望作為患者預(yù)后判斷的重要標(biāo)志物。

鼻咽癌；EBI3；p35；IL-35；免疫組織化學(xué)

EBI3是IL-12家族成員IL-27和IL-35的組成亞基，屬于可溶型細(xì)胞因子受體樣亞單位。p35卻是IL-12家族成員IL-12和IL-35的組成亞基，是一個(gè)單體4-折疊螺旋束樣細(xì)胞因子亞單位。IL-12和IL-27均在腫瘤免疫及炎癥反應(yīng)中具有重要作用[1，2]。IL-35作為2007年新發(fā)現(xiàn)的一種抗炎癥細(xì)胞因子，其在腫瘤免疫中的作用還不清楚[3-4]。基因表達(dá)譜分析顯示，IL-35具有廣泛的組織分布[5]。研究顯示胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞EBI3和p35基因均高表達(dá)，且在人類足月正常胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中EBI3表達(dá)與p35表達(dá)相關(guān)[6]。近來(lái)研究報(bào)道，EBI3和p35均表達(dá)于人類的大B細(xì)胞淋巴瘤，黑色素瘤，結(jié)腸癌以及多種腫瘤細(xì)胞株[7]。本研究我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)EBI3和p35在鼻咽癌(NPC)、癌旁黏膜和鼻咽黏膜慢性炎組織中的表達(dá)情況，探討EBI3和p35在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相互關(guān)系，為揭示IL-35在腫瘤免疫中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年3月至2013年4月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科，經(jīng)病理科確診的50例NPC新鮮組織標(biāo)本、30例同期的癌旁黏膜組織和25例鼻咽黏膜慢性炎患者炎癥組織置于液氮罐保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)WHO腫瘤組織學(xué)分型(1991)標(biāo)準(zhǔn)，50例NPC組織中21例為角化型鱗狀細(xì)胞癌，29例為非角化型鱗狀細(xì)胞癌，其中30例NPC患者發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，20例未發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC)聯(lián)合制定的TNM分期法，將NPC病例分為：T1期10例、T2期16留、T3期19例和T4期5例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑與方法 兔抗人EBI3抗體、兔抗人p35抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；EBI3和p35抗體都按1:300稀釋，免疫組織化學(xué)Power Vision試劑盒和DAS顯色劑均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，已知陽(yáng)性結(jié)腸癌標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。EBI3、p35染色陽(yáng)性呈棕黃色，均表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，每張切片在40倍顯微鏡下順序找1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度。對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)計(jì)分，＜5%=0，5%～25%=1，26%～50%=2，51%～75%=3，＞75=4。根據(jù)染色強(qiáng)度，無(wú)色=0，淡黃色=1，棕黃色=2，深棕色=3進(jìn)行評(píng)分，累積0分為“-”，1～2分為“+”，3～4分為“++”，5～ 7分為“+++”。將“-～+”視為蛋白低表達(dá)，“++～+++”視為蛋白高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較行χ2檢驗(yàn)，鼻咽癌組織EBI3和p35表達(dá)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EBI3和p35在鼻咽組織中的表達(dá) EBI3陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。NPC組織中EBI3高表達(dá)率為62.0%(31/50)，顯著高于癌旁黏膜組織中的36.7%(11/30)(χ2=4.83，P＜0.05)和鼻咽黏膜慢性炎患者炎癥組織中的36.0%(9/25)(χ2=4.53，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。癌旁黏膜組織和鼻咽黏膜慢性炎患者炎癥組織中EBI3高表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.001，P＞0.05)。p35陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。NPC組織中p35高表達(dá)率為60.0%(30/50)，顯著高于癌旁黏膜組織中的33.3% (10/30)(χ2=5.33，P＜0.05)和鼻咽黏膜慢性炎患者炎癥組織中的36.0%(9/25)(χ2=3.85，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。癌旁黏膜組織和鼻咽黏膜慢性炎患者炎癥組織中p35高表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.04，P＞0.05)。

2.2 EBI3、p35與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系 EBI3、p35的表達(dá)程度均與鼻咽癌臨床分期、組織學(xué)分型和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與鼻咽癌患者的發(fā)病年齡及性別無(wú)關(guān)，見(jiàn)表1。T3～T4期NPC患者中EBI3高表達(dá)率及p35高表達(dá)率顯著高于T1～T2期患者；非角化型鱗癌NPC患者癌組織中EBI3高表達(dá)率及p35高表達(dá)率顯著高于角化型鱗癌患者；有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者癌組織中EBI3高表達(dá)率及p35高表達(dá)率顯著高于無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌患者。

表1 EBI3、p35蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

2.3 EBI3和p35的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，NPC組織中EBI3和p35表達(dá)之間呈正相關(guān)(r=0.328，P＜0.05)。

3 討論

目前已有大量研究證實(shí)IL-35與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者自發(fā)產(chǎn)生一種抗原特異的中有一群特異的分泌IL-35的CD8+CTLA-4+T細(xì)胞亞群，該亞群在免疫接種過(guò)程中，以IL-35依賴的方式阻止腫瘤抗原特異性反應(yīng)[8]。Wang等[9]初步研究大B細(xì)胞淋巴瘤，鼻咽癌，黑色素瘤組織均能產(chǎn)生IL-35，且他們?cè)趯?duì)黑色素瘤的研究發(fā)現(xiàn)IL-35通過(guò)增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的積累、腫瘤血管生成、抑制腫瘤的免疫力促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。Long等[10]發(fā)現(xiàn)多種癌細(xì)胞株(A549，SW480，BEL-7402，HepG2，SiHa，HPAC，MDA-MB-231，MCF-7)中存在IL-35亞基表達(dá)，且TNF-α和IFN-C刺激能導(dǎo)致IL-35的表達(dá)增加，過(guò)度表達(dá)的IL-35抑制在體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期，并介導(dǎo)血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

筆者在50例NPC患者癌組織中發(fā)現(xiàn)IL-35亞基EBI3和p35表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁組織及鼻咽黏膜慢性炎患者炎癥組織(P均＜0.05)，說(shuō)明EBI3和p35表達(dá)與NPC發(fā)病有關(guān)，并提示IL-35與NPC發(fā)生、發(fā)展及惡變中具有重要作用，特別是NPC患者癌組織中EBI3和p35的表達(dá)程度與鼻咽癌臨床分期、組織學(xué)分型和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。此外，NPC組織中EBI3和p35表達(dá)之間呈顯著正相關(guān)(r=0.328，P＜0.05)。這些研究進(jìn)一步說(shuō)明IL-35在鼻咽癌免疫逃逸中具有重要作用，但其確切機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

[1]Del Vecchio M,Bajetta E,Canova S,et al.Interleukin-1:Biological properties and clinical application[J].Clin Cancer Res,2007,13 (16):4677-4685.

[2]Ho MY,Leu SJ,Sun GH,et al.IL-27 derectly restrains lung tumorigenicity by suppressing cyclooxygenase-2-mediated activities[J].J Immunol,2009,183(10):6217-6226.

[3]Chaput N,Louafi S,Bardier A,et al.Identification of CD8+CD25+Foxp3+suppressive T cells in colorectal cancer tissue[J].Gut,2009, 58(4):520-529.

[4]Lau KM,Cheng SH,Lo KW,et al.Increase in circulating Foxp3+ CD4+CD25(high)regulatory T cells in nasopharyngeal carcinoma patients[J].Br J Cancer,2007,96(4):617-22.

[5]Li X,Mai J,Virtue A,et al.IL-35 is a novel responsive anti-inflammatory cytokine—a new system of categorizing anti-inflammatory cytokines[J].PLoS One,2012,7(3):e33628.

[6]Devergne O,Coulomb-L'Herminé A,Capel F,et al.Expression of Epstein-Barr virus-induced gene 3,an interleukin-12 p40-related molecule,throughout human pregnancy:involvement of syncytiotrophoblasts and extravillous trophoblasts[J].Am J Pathol,2001, 159(5):1763-1776.

[7]Long J,Zhang X,Wen M,et al.IL-35 over-expression increases apoptosis sensitivity and suppresses cell growth in human cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,430(1):364-369.

[8]Olson BM,Jankowska-Gan E,Becker JT,et al.Human prostate tumor antigen-specific CD8+regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade[J].The Journal of Immunology,2012, 189:5590-5601.

[9]Wang Z,Liu JQ,Liu Z,et al.Tumor-derived IL-35 promotes tumor growth by enhancing myeloid cell accumulation and angiogenesis [J].J Immunol,2013,190(5):2415-2423.

[10]Long J,Zhang X,Wen M,et al.IL-35 over-expression increases apoptosis sensitivity and suppresses cell growth in human cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,430(1):364-369.

Expression and clinical significance of EBI3 and p35 in nasopharygeal carcinoma.

LIU Yan1,ZENG Jin-cheng2, LIANG Xiao-quan1.1.Department of Otorhinlaryngology,Naihai People's Hospital,Foshan 528200,Guangdong, CHINA;2.Institute of Laboratory Medicine of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,Guangdong,CHINA

Objective To detect the expression of EBI3 and p35 in nasopharyngeal carcinoma(NPC)and to analyze the clinical significance of them in NPC patients.Methods Immunohistochemistry was used to detect 50 cases of NPC patients,30 cases of adjacent mucosa tissues and 25 cases of nasopharyngeal mucosa chronic inflammatory patients.The relationship of EBI3 or p35 with clinical stage,pathological type and lymph node metastasis were also analyzed on 50 cases of NPC patients.Results The high expression rates of EBI3 in NPC patients was significantly higher than those in adjacent mucosa(62.0%to 36.7%,χ2=4.83,P＜0.05)and nasopharyngeal mucosa chronic inflammatory tissue(62.0%to 36.0%,χ2=4.53,P＜0.05).The high expression rates of EBI3 in stage T3～T4NPC patients were significantly higher than those in stage T1～T2NPC patients(χ2=17.24,P＜0.01).The high expression rates of EBI3 in non-keratinizing squamous carcinoma patients was significantly higher than those in keratinizing squamous carcinoma patients(χ2=8.78,P＜0.01),and in NPC patients having a cervical lymph node metastasis than those without lymph node metastasis(χ2=14.49,P＜0.01).In NPC patients cancer tissues,we also found the high expression rates of p35 were significantly higher than those in adjacent mucosa(60.0%to 33.3%,χ2=5.3,P＜0.05)and nasopharyngeal mucosa chronic inflammatory tissue(60.0%to 36.0%,χ2=3.85,P＜0.05).The high expression rates of p35 on stage T3～T4NPC patients were significantly higher than those on stage T1～T2NPC patients(χ2=19.28,P＜0.01),in non-keratinizing squamous carcinoma patients than those in keratinizing squamous carcinoma patients(χ2=7.24,P＜0.01),and in NPC patients having a cervical lymph node metastasis than those without lymph node metastasis(χ2=5.56,P＜0.05).The expression of EBI3 in NPC patients was positively related to the expression of p35(r=0.328,P＜0.05). Conclusion The high expression of EBI3 and p35 in NPC patients may relevant to tumor pathogenesis and progression,and maybe an important marker for NPC prognosis.

Nasopharygeal carcinoma;EBI3;p35;IL-35;Immunohistochemistry

R739.63

A

1003—6350（2014）18—2670—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1048

2014-03-16)

佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：201308188)

劉 艷。E-mail：liuyan123119@sina.com