高碳酸培養環境對A549細胞合成、分泌肺泡表面活性蛋白C的影響

黎陽，彭丹暉，老啟芳，黃英明，覃韜，謝顯龍，黃冰

（廣西醫科大學附屬腫瘤醫院重癥醫學科，廣西南寧 530021）

高碳酸培養環境對A549細胞合成、分泌肺泡表面活性蛋白C的影響

黎陽，彭丹暉，老啟芳，黃英明，覃韜，謝顯龍，黃冰

（廣西醫科大學附屬腫瘤醫院重癥醫學科，廣西南寧 530021）

目的研究不同培養濃度CO2對A549活性、合成和分泌肺泡表面活性蛋白C(SP-C)的影響，為允許性高碳酸血癥的肺保護機制提供理論依據。方法A549細胞按不同CO2培養濃度分為A組(5%CO2)、B組(10%CO2)和C組(18%CO2)。細胞培養24 h、36 h、48 h后，采用噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞活性；免疫印跡法檢測細胞內肺泡表面活性蛋白C前體蛋白(proSP-C)的水平；酶聯免疫吸附測定法檢測細胞培養上清液中SP-C的濃度。結果(1)與A組比較，B組各觀測點的細胞活性均增高；C組的細胞活性則在36 h、48 h降低。(2)B組36 h、48 h細胞培養液中SP-C濃度較A組升高，但是細胞內proSP-C差異無統計學意義。(3)與A組比較，C組24 h培養液中的SP-C濃度已開始降低，但胞內proSP-C在36 h才開始下降。結論(1)一定的CO2培養濃度升高不影響A549的活性，對SP-C的合成和分泌起促進作用；(2)過高的CO2培養濃度可抑制A549的活性、SP-C的合成和分泌。

高碳酸血癥；A549細胞；肺泡表面活性蛋白C；肺泡表面活性蛋白C前體蛋白

在呼吸機通氣過程中，為避免/減輕患者的呼吸機相關性肺損傷(Ventilator associated lung injury，VALI)，往往采用小潮氣量的肺保護通氣策略。這種以肺保護為目的，降低潮氣量而導致的PaCO2升高被稱為允許性高碳酸血癥(Permissive hypercapnia，PHC)。PHC剛開始時被認為是小潮氣量通氣的結果，近年來研究發現PHC本身就具有肺保護的作用。在VALI的病理過程中，肺泡Ⅱ型細胞(ATⅡ)對維持肺功能、修復肺泡上皮損傷起著重要的作用；肺泡表面活性蛋白C(Surfactant protein C，SP-C)是一種由ATⅡ分泌至肺泡腔內的特異性蛋白，具有降低肺泡表面張力，維持肺泡形態穩定的功能[1]；通過對ATⅡ細胞內SP-C前體蛋白proSP-C檢測，可評估ATⅡ的活性及表達SP-C的能力[2]。A549是來源于肺腺癌的細胞系，是常用的ATⅡ細胞模型[3]。為了探討PHC自身的肺保護機理，本研究在2012年4月至2013年4月期間，選用不同的CO2濃度培養A549，通過噻唑藍比色法(MTT)了解高碳酸環境對A549生物活性的影響；Western blot檢測細胞內proSP-C濃度、ELISA檢測培養液中SP-C的量，了解CO2對A549功能活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器(1)細胞株：A549細胞。(2)實驗試劑：1640細胞培養液(Hyclone)；胎牛血清(Hyclone)；二甲基亞砜(Sigma)、噻唑藍(Sigma)；SP-C的ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；RIPA裂解液(中國碧云天生物技術研究所)；SP-C兔抗人多克隆抗體(eBioscience)；β-actin內參抗體(Abcam)；HRP標記的山羊抗兔二抗(Santa)。(3)實驗儀器：BDInflux流式細胞儀(碧迪醫療器械上海有限公司)；CO2細胞培養箱(美國Alpha Innotech)；丹麥雷度800血氣儀；酶標分析儀(上海翔升生物科技有限公司)。

1.2 細胞傳代培養A549細胞懸液加入RPMI-1640培養基，置于37℃，5%CO2濃度，濕飽和的細胞培養箱培育；傳代后液氮凍存。

1.3 實驗模型的建立及分組凍存A549細胞復蘇后培養，細胞周期同步化；把對數生長期的細胞懸液接種96孔培養板，每孔200 μl，細胞數約為4 000個。待細胞貼壁生長后隨機置入3個不同CO2濃度的細胞培養箱中培養，在24 h、36 h、48 h培養后進行檢測，分組及分組條件如下：A組，設置細胞培養箱中CO2濃度為5.0%，37℃，水飽和；B組，設置細胞培養箱中CO2濃度為10.0%，37℃，水飽和；C組，調整細胞培養箱中CO2濃度為18.0%，37℃，水飽和。

1.4 檢測方法(1)噻唑藍(MTT)比色法測細胞活性,每個時點設15個復孔。每個孔在觀測點加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，并繼續孵育4 h；棄去孔內培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后酶標儀檢測各孔對490 nm波長的吸光度(OD)。(2)細胞培養孔上清液的血氣分析，每個時點6個復孔。2 ml注射器采集觀測時點細胞培養孔的上清液；血氣分析儀對上清液進行血氣分析。(3)Western blot檢測細胞中proSP-C蛋白的表達，每個時點6個復孔。RIPA裂解液提取每個培養孔的細胞總蛋白；BCA法測提取細胞總蛋白的濃度；聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，β-actin作為內參抗體；轉膜、洗膜、封閉，proSP-C多抗孵育、熒光二抗孵育后顯影；proSP-C蛋白條帶灰度和內參灰度的比值計算蛋白相對量。(4)ELISA檢測細胞培養上清中SP-C，每個時點6個復孔。采集觀測時點細胞培養孔的上清液；按試劑盒操作說明檢測上清液中SP-C濃度。

1.5 統計學方法采用SPSS10.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±S)表示，組間比較采用方差分析(SNK法)，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度CO2條件下培養A549細胞MTT結果比較B組與A組比較，24 h(q=5.72，P＜0.01)、36 h(q=3.45，P＜0.05)OD值均增高；C組與A組比較，24 h(q=8.58，P＜0.01)、36 h(q=8.05，P＜0.01)、48 h(q= 7.59，P＜0.01)的OD值均降低，見表1。

2.2 不同濃度CO2條件下培養液血氣分析結果B、C兩組pH值均小于A組相同時點(P＜0.01)，B、C兩組間比較，C組的pH值較B組更低(P＜0.01)。B、C兩組的PCO2高于A組相同時點(P＜0.01)，B、C兩組間比較，C組的PCO2較B組更高(P＜0.01)。B、C兩組的HCO3-高于A組相同時點(P＜0.01)，B、C兩組間比較，36 h、48 h時C組的PCO2較B組更高(P＜0.01)，見表2。

表2 培養液血氣分析比較結果（n=6±s）

表2 培養液血氣分析比較結果（n=6±s）

注：與A組比較，aP＜0. 01；與B組比較，bP＜0.01。1 mmHg=0.133 kPa。

組別項目pH A B C F值P值PCO2(mmHg) A B C F值P值HCO3-(mmol/L) A B C F值P值24 h 7.25±0.03 7.10±0.04a6.93±0.03ab135.48 0.00 33.7±2.3 52.8±4.1a79.0±6.3ab150.67 0.00 14.20±0.09 15.57±0.31a15.55±0.12a93.63 0.00 36 h 7.21±0.02 7.06±0.02a6.92±0.02ab316.61 0.00 33.7±2.3 52.8±1.9a79.5±3.8ab408.14 0.00 12.13±0.14 14.23±0.14a15.50±0.20ab658.33 0.00 48 h 7.14±0.01 7.05±0.05a6.93±0.04ab47.43 0.00 32.2±1.5 53.0±5.4a75.7±8.2ab86.37 0.00 10.52±0.32 13.73±0.15a15.10±0.18ab632.27 0.00

注：與A組比較，aP＜0. 05；bP＜0.01。

2.3 A549 細胞內proSP-C表達水平的比較免疫印跡法檢測proSP-C的結果如圖1所示。B組與A組比較，A549細胞內SP-C水平在各時點差異無統計學意義(P＞0.05)；C組與A組比較，A549細胞內proSP-C在36 h(q=5.88，P＜0.01)，48 h(q=6.16，P＜0.01)表達降低，見表3。

圖1 A549細胞內proSP-C的表達

表3 A549細胞內proSP-C表達水平的比較(OD值，±s)

表3 A549細胞內proSP-C表達水平的比較(OD值，±s)

注：與A組比較，aP＜0. 05；bP＜0.01。

組別A組B組C組F值P值24 h 0.58±0.15 0.63±0.20 0.49±0.08 1.31 0.30 36 h 0.63±0.09 0.65±0.18 0.31±0.14b10.90 0.00 48 h 0.55±0.11 0.49±0.19 0.23±0.02a10.71 0.00

2.4 A549細胞培養上清液中SP-C濃度的比較B組與A組比較，SP-C在36 h(q=18.43，P＜0.01)，48 h (q=43.28，P＜0.01)濃度增加；C組與A組比較，SP-C在24 h(q=4.51，P＜0.05)、36 h(q=23.96，P＜0.01)、48 h (q=59.51，P＜0.01)濃度降低，見表4。

表4 A549細胞培養上清中SP-C濃度比較(ng/ml，±S)

表4 A549細胞培養上清中SP-C濃度比較(ng/ml，±S)

注：與A組比較，aP＜0. 05；bP＜0.01。

組別A組B組C組F值P值24 h 20±1.2 21±2.2 18±1.3a5.27 0.02 36 h 21±0.9 31±2.0b18±0.7b157.36 0.00 48 h 26±1.0 42±1.1b20±0.5a946.28 0.000

3 討論

細胞開放培養的CO2濃度一般為5%，過高的CO2濃度可影響培養細胞的活性，甚至導致細胞凋亡或死亡。隨著細胞培養箱內CO2濃度升高，溶解在細胞培養液中CO2必然增加，導致培養液的PCO2跟隨著升高；細胞培養液是細胞接觸的外環境，其理化性質的改變直接影響細胞的生物活性。溶解在細胞培養液中的CO2和HCO3-形成緩沖對，維持培養液pH值的穩定，從而保證了細胞的正常生長。B、C兩組培養液pH值較A組都明顯下降，且CO2培養濃度越高下降越明顯。雖然培養液中HCO3-可一定程度上緩沖pH的升高，但隨著CO2溶解量的增加，培養液的pH值逐漸出現了下降。

MTT實驗是一種檢測細胞存活和生長的方法，可間接反映培養皿中存活細胞的數量。B組的MTT實驗結果提示：隨著CO2培養濃度的升高，一定程度的pH值降低或PCO2升高可刺激A549細胞活性的升高。有研究提示：在對A549細胞損傷模型的研究中，CO2培養濃度一定程度的升高可減少細胞凋亡蛋白酶活化和降低細胞凋亡率[4]。動物實驗亦報道：允許性高碳酸血癥可減少大鼠移植肺ATⅡ的細胞器損壞和凋亡率，改善大鼠移植肺的肺功能[5]；對大鼠移植肺的保護機理可能是調節氧化和抗氧化的平衡，減少炎癥介質、氧自由基對ATⅡ的攻擊。在本研究中，B組細胞活性升高可能和凋亡受抑制，細胞器受損減輕有關。C組的MTT實驗結果提示：培養環境pH值過低或PCO2過高可降低A549的細胞活性，這樣的結果可能和高碳酸環境對細胞的毒性有關。有研究證實：代謝性酸中毒可抑制細胞內呼吸，降低細胞的代謝水平，抑制細胞內能量代謝[6]；Vohwinkel等[7]報道：過高的PCO2可對線粒體功能產生損害，ATP生成減少抑制細胞的能量代謝，最終導致細胞增殖受抑。

與A組相比較，B組培養上清液中SP-C濃度在36 h、48 h明顯增高，提示了培養液中一定的pH下降和PCO2升高可以刺激SP-C的分泌。然而B組較A組A549細胞中proSP-C表達水平未表現出升高，與培養液中SP-C濃度變化不吻合，考慮可能與proSP-C轉化加快有關。由于proSP-C轉化SP-C并分泌加快，因此B組的proSP-C并未檢測出升高。有關pH值下降促使proSP-C轉化的推斷還需進一步研究證實。C組各時點培養液中SP-C的濃度較A組都要降低。雖然C組A549細胞中proSP-C表達水平在24 h較A組無變化，但36 h、48 h的proSP-C表達水平出現了明顯的下降。上述實驗結果提示：過高的PCO2環境可降低A549活性，影響其細胞內部特異性蛋白SP-C的合成與分泌。有研究表明：ATⅡ除了能夠增殖進行自我更新，并可以通過分裂脫去顆粒而轉分化為其他細胞[8]；高濃度CO2是否可導致A549細胞向其他細胞的轉分化，導致了SP-C表達、合成、分泌的減少還有待證實。

綜上所述，允許性高碳酸血癥本身就具有肺保護的作用，并非僅僅是肺保護性通氣策略的結果。然而，高碳酸血癥超出了一定范圍，不但不具有肺保護的功能，而且還會抑制ATⅡ增殖，影響肺上皮修功能及其完整性，可能導致或加重急性肺損傷(ALI)。

參考資料：

[1]Pohlmann G,Iwatschenko P,Koch W,et al.A novel continuous powder aerosolizer(CPA)for inhalative administration of highly concentrated recombinant surfactant protein-C(rSP-C)surfactant to preterm neonates[J].J Aerosol Med Pulm Drug Deliv,2013,26 (6):370-379.

[2]Glasser SW,Senft AP,Maxfield MD,et al.B Genetic replacement of surfactant protein-C reduces respiratory syncytial virus induced lung injury[J].Respir Res,2013,14(1):19.

[3]Wondwossen A,Abdulaziz A,Alghaithy B,et al.Surfactant lipids regulate LPS-induced interleukin-8 production in A549 lung epithelial cells by inhibiting translocation of TLR4 into lipid raft domains [J].J Lipid Res,2010,51(2):334-344.

[4]Ando T,Mikawa K,Nishina K,et al.Hypocapnic alkalosis enhances oxidant-induced apoptosis of human alveolar epithelial type II cells[J].J Int Med Res,2007,35(1):118-126.

[5]申東方,王玲,譚晶,等.治療性高碳酸血癥對大鼠移植肺肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響[J].中華麻醉學,2011,31(4):4795-4797.

[6]Jay B.Hypercapnia causes cellular oxidation and nitrosation in addition to acidosis:implications for CO2chemoreceptor function and dysfunction[J].JAppl Physiol,2010,108(6):1786-1795.

[7]Vohwinkel CU,Lecuona E,Sun H,et al.Elevated CO2levels cause mitochondrial dysfunction and impair cell proliferation[J].J Biol Chem,2011,286(43):37067-37076.

[8]Bishop AE.Pulmonary epithelial stem cells[J].Cell Prolif,2004,37 (1):89-96.

Effect of different concentrations of carbon dioxide on the synthesis and secretion of surfactant protein C in A549 cells.

LI Yang,PENG Dan-hui,LAO Qi-fang,HUANG Ying-ming,QIN Tao,XIE Xian-long,HUANG Bing. Intensive Care Unit,Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of different concentrations of carbon dioxide on the synthesis and secretion of surfactant protein C(SP-C)in A549 cells.MethodsA549 cells were divided into group A(5% CO2),group B(10%CO2)and group C(18%CO2)according to different concentrations of carbon dioxide.After culturing for 24,36 and 48 hours,the survival state of those cells was estimated by MTT assay,the precursor protein of surfactant protein-C(proSP-C)was measured by western blot,and the concentration of SP-C in the cell culturesupernatants was measured by ELISA method.Results(1)Compared with group A,group B showed higher activity at 24 h, 36 h,and 48 h,while group C had a lower activity at 36 h and 48 h(MTT assay).(2)SP-C concentration in the culture supernatants of group B was higher than that of group A,however,there was no statistical difference in the expression of proSP-C.(3)Compared with group A,an increasing of SP-C concentration in 24 h culture supernatants and a decreasing of proSP-C concentration in 36 h culture supernatants in group C were observed.Conclusion(1)10%CO2dose not affect the proliferation of A549 cells,but can promote the synthesis and secretion of SP-C in A549 cells;(2) 18%CO2can inhibite the synthesis and secretion of SP-C as well as limit the proliferation inA549 cells.

Hypercapnia;A549;SP-C;proSP-C

R329.2+5

A

1003—6350（2014）20—2970—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.20.1169

2014-04-06)

廣西醫療衛生重點科研課題（編號：重2010078）

黃冰。E-mail：hhhbing@163.com