小鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立及評價

王朗，盧燕云，周琴，水小蘭

（1.武漢大學人民醫院心血管內科，湖北武漢 430060；2.武漢大學心血管病研究所，湖北武漢 430060；3.武漢大學人民醫院神經內科，湖北武漢 430060）

·論著·

小鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立及評價

王朗1，2，盧燕云2，周琴3，水小蘭1

（1.武漢大學人民醫院心血管內科，湖北武漢 430060；2.武漢大學心血管病研究所，湖北武漢 430060；3.武漢大學人民醫院神經內科，湖北武漢 430060）

目的探討穩定的小鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備和評價方法，評價缺血時間的延長對缺血再灌注損傷的影響。方法采用硅膠線栓暫時性阻塞小鼠大腦中動脈制備腦缺血再灌注損傷模型，通過神經功能評分、TTC染色、伊文氏藍染色、Tunel染色、免疫熒光染色等方法評價45 min和60 min缺血再灌注時間所導致的梗死體積、神經功能、神經元凋亡以及氧化應激水平的差異。結果與45 min組相比，60 min缺血再灌注損傷使腦梗死體積增加了78.21%、神經功能評分升高了31.66%，神經元凋亡比例增加了44.49%，血腦屏障的破壞程度和氧化應激水平隨著缺血時間的增加也明顯增高。結論通過嚴格的手術操作和嚴密的術中監測，可以獲得穩定的小鼠腦缺血再灌注損傷模型，缺血時間的延長顯著增加了腦組織的損傷。

腦缺血再灌注損傷；凋亡；氧化應激；小鼠

腦卒中是多種腦血管疾病的嚴重表現形式，具有極高的致殘率和較高的致死率，是危害人類生命健康的最主要疾病之一。近30年來我國腦卒中發病率逐年升高，以每年8.7%的速度上升，目前已達到185～219/10萬人，每年至少有200萬新發病例[1]。其中，缺血性腦卒中是腦卒中最常見的發病類型，在某些地區可以占到整個腦卒中病例的79%。通過組織纖溶酶原激活劑(tPA)溶栓治療恢復腦組織供血是目前臨床上治療缺血性腦卒中唯一有效的方法。但由于嚴格的治療時間窗限制，只有不到5%的卒中患者有機會接受tPA溶栓治療[2]。而在持續較長時間的腦缺血后，即使恢復了阻塞血管的血流灌注仍會導致腦組織不可逆的損傷，并且增加腦出血的風險[3]。因此，闡明腦缺血以及再灌注過程中的病理生理機制，研究有效的卒中治療靶點對于臨床腦卒中的治療具有重要意義。

小鼠和基因工程小鼠資源是目前疾病機制研究、基因功能研究、藥物創制等領域最重要的動物模型之一，也是這些領域創新研究的必要條件[4]。利用基因工程小鼠針對腦卒中病理過程中的各個分子環節進行研究，對闡明腦卒中發生發展過程中的分子機制，尋找腦卒中治療的分子靶點具有重要的意義。而建立穩定的小鼠腦缺血及再灌注損傷的動物模型并建立系統的模型評價體系是利用基因工程小鼠研究腦卒中病理生理機制的前提及關鍵。本文將系統闡述小鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備及評價方法，對比45 min和60 min缺血再灌注時間所導致的損傷差異，并對缺血再灌注損傷后神經元的凋亡及氧化應激損傷進行評價。這些實驗方法及所得到的實驗數據將為我們后續以基因工程小鼠為研究對象的科學研究提供重要的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用雄性小鼠，11～12周齡，體重25～30 g，背景為C57BL/6的野生型小鼠(購自北京華阜康生物科技有限公司，質量合格證號：949431)，所有實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級實驗動物中心。SPF級小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養條件：室溫22℃～24℃，濕度40%～70%，明暗交替照明時間為12 h，自由飲水攝食。

1.2 實驗動物分組60只實驗小鼠，通過大腦中動脈缺血再灌注建立腦梗死模型(I/R)，隨機分為45 min缺血再灌注損傷組(30只)和60 min缺血再灌注損傷組(30只)。

1.3 小鼠腦缺血再灌注損傷模型通過暫時性大腦中動脈阻塞(Transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)手術制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型[5-6]。操作流程如下：(1)使用3%異氟烷麻醉小鼠，8%硫化鈉脫去頸部的鼠毛，顱頂鼠毛用手術剪迅速剪掉，3%活力碘消毒頸部及顱頂皮2次，75%酒精脫碘1次。(2)在小鼠的顱頂部位橫向切口，暴露顱骨，用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結締組織。將激光多普勒血流儀(Periflux System 5010，Perimed)的光纖探頭用生物膠固定在前囟后方2 mm、左側5 mm的部位，即大腦中動脈供血區域。(3)將小鼠仰臥固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。用微動脈夾暫時夾閉ICA、CCA，在ECA遠心端結扎和剪一小口，將硅膠線栓(6～0，Doccol)由剪口送入ICA，當線栓進入深度在9～11 mm時遇阻力，此時可在多普勒血流儀器上觀察到血流的急劇下降，固定線栓。(4)從線栓進入腦血管至血流下降遇阻力時開始計時，45 min或60 min后將線栓拔出，并將ECA近心端結扎，迅速松開CCA處動脈夾。觀察血流恢復情況，血流下降大于基礎血流的75%以上，血流恢復達基礎血流的70%以上，視為缺血再灌注模型制備成功。(5)縫合小鼠頸部及頭部皮膚，并用活力碘消毒傷口。手術結束后，將小鼠放在28℃溫箱中，待小鼠蘇醒后轉入飼養籠中常規飼養。

1.4 梗死體積的評價采用TTC染色法評價梗死體積[5]。抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取出腦組織，將其放入1 mm小鼠腦模，置于-20℃冰箱冰凍后切成1 mm厚的切片，共切7片。將切片立即置于10 ml 2%TTC溶液中，37℃恒溫孵育10 min。正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區呈蒼白色。用10%中性福爾馬林溶液固定腦組織切片后拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量并計算腦梗死體積。梗死體積%=(對側大腦半球體積-梗死側未梗死體積)/(對側大腦半球體積×2)×100%。

1.5 神經功能的評價在tMCAO手術后的24 h對小鼠進行神經功能及行為學評分，采用基于Berderson神經功能評分改進的9分制評分方法[7]。0分：無神經受損的癥狀；1分：提尾時對側前肢蜷曲，或者不能完全到達患側前肢；2分：提尾時對側肩膀內收；3分：平推，向對側推動時阻力下降；4分：可自發的向各個方向運動，但在脫尾巴時只向對側轉彎；5分：自發運動時轉圈或只向對轉；6分：無自主運動，只在刺激時運動；7分：無自主運動，刺激時也無運動；8分：與腦缺血有關的死亡。

1.6 血腦屏障破壞程度的評價通過伊文氏藍染色法評價血腦屏障的破壞情況[8]。用磷酸鹽緩沖液(PBS)配置2%的伊文氏藍染液，在缺血60 min后在灌注的即刻，按照4 ml/kg體重將伊文氏藍染液注入小鼠體循環。24 h后麻醉小鼠，用PBS灌流小鼠全身組織器官后完整取出腦組織，沿中線將梗死半球和非梗死半球分開，放入EP管中-80℃保存。進行檢測時從-80℃冰箱中取出腦組織，迅速向腦組織里加入3顆預冷的鋼珠和1 ml冰50%(w/v)三氯乙酸溶液，蓋好EP管蓋，將EP管放入研磨儀研磨罐中，30次/s，碾磨1 90 s。于4℃下離心(1 000 g，5 min)后取200 μl上清液，用酶標儀610 nm測吸光值。參照Evens Blue標準曲線，計算腦組織中Evens Blue含量(μg/g大腦重量)。

1.7 神經元凋亡的評價使用Tunel染色法評價神經元的凋亡。取缺血再灌注損傷后24 h的腦組織制備8 μm厚的冰凍切片。將冰切組織切片置于(pH 7.4)1%的多聚甲醛中，室溫固定水解10 min；PBS洗兩次，每次5 min；然后根據Tuenl試劑盒的操作流程，依次加入平衡緩沖液，TdT酶反應液，終止/洗滌緩沖液，抗地高辛抗體進行孵育。最后碘化丙啶復染，封片干燥，-20℃避光保存；在熒光顯微鏡下觀察計數凋亡神經元細胞。

1.8 氧化應激水平的評價8OHDG和4HNE是反映氧化應激水平的兩個重要標志[9]。8OHDG是DNA氧化損傷的標志物，4NHE則是脂質氧化損傷的標志物。取缺血再灌注損傷后24 h的腦組織制備8 μm厚的冰凍切片。將冰切組織切片置于1%的多聚甲醛(pH 7.4)中，室溫固定15 min。用含10%羊血清的PBS漂洗切片后，在組織上滴加抗4HNE(ab48506，Abcam，Cambridge，MA)或8OHDG抗體(sc-66036，Santa cruz，CA)，4°C孵育過夜。PBS漂洗后加入相應二抗37°C孵育1 h。PBS漂洗后DAPI復染細胞核，封片干燥，-20℃避光保存；在熒光顯微鏡下觀察計數陽性細胞數。

1.9 統計學方法全部數據使用統計軟件包SPSS11.0進行處理，所有數據均以均數±標準差(±S)表示，多組間比較采用Oneway-ANOVA，兩組間比較用非配對Student's t-test分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腦梗死體積的評價45 min及60 min缺血再灌注均造成了明顯的腦梗死。手術24 h后取材評價梗死體積百分比，45 min組為(24.23±4.11)mm3， 60 min組為(43.18±3.20)mm3(圖1)，兩組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)。激光多普勒血流儀監測顯示，無論是45 min組還是60 min組，缺血過程中的血流下降程度以及再灌注過程中的血流恢復程度比較差異均無統計學意義(圖2)。

2.2 神經功能評價神經功能評分顯示，45 min及60 min缺血再灌注損傷均造成了顯著的神經功能受損。45 min組神經功能評分為(3.98±0.77)分，60 min組的神經功能評分為(5.24±0.82)分，兩者比較差異具有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 血腦屏障通透性的評價45 min和60 min缺血再灌注損傷均能造成明顯的血腦屏障破壞，表現為梗死側腦組織出現明顯的伊文氏藍染色(圖3)。組織勻漿液分光光度法檢測伊文氏藍的濃度顯示，60 min組梗死側為(22.75±4.38)μg(伊文氏藍)/g(腦組織)，對側為(3.24±1.77)μg/g。45 min組梗死側腦組織伊文氏藍含量為(11.36±2.92)μg/g，對側為(2.78±0.94)μg/g。缺血側與對側比較，以及60 min組的缺血側與45 min組的缺血側比較，差異均具有統計學意義。

圖1 TTC染色示梗死體積

圖2 多普勒血流監測示血流下降和恢復的程度

圖3 伊文氏藍染色示血腦屏障破壞程度

2.4 神經元凋亡水平的評價45 min和60 min腦缺血再灌注損傷后，在梗死周邊區可以觀察到明顯的神經元凋亡，即Tunel和Neun雙染陽性的細胞。45 min組梗死側腦組織梗死周邊區Tunel陽性細胞率為(41.65±2.48)%，60 min組為(60.18±1.40)%，兩組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖4。

2.5 氧化應激水平的評價45 min和60 min缺血再灌注損傷后，在梗死周邊區可以檢測到大量4HNE和8OHDG陽性細胞，其中45 min組4HNE陽性細胞計數為(43.27±6.43)個/200倍視野，60 min組4HNE陽性細胞計數為(72.67±7.82)個/200倍視野，兩組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。45 min組8OHDG陽性細胞計數為(36.96±4.54)個/ 200倍視野，60 min組8OHDG陽性細胞計數為(61.45±4.36)個/200倍視野，兩組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

圖4 Tunel和Neun雙染示神經元凋亡

圖54 HNE和8OHDG染色示氧化應激水平

3 討論

本研究使用C57BL/6小鼠，建立了穩定的小鼠腦缺血再灌注損傷模型，通過對比45 min缺血時間和60 min缺血時間，發現缺血時間的延長顯著地擴大了梗死體積，加重了神經功能損傷，并導致了更為嚴重的血腦屏障破壞、神經元凋亡以及氧化應激損傷。

目前國內研究腦缺血再灌注損傷大多使用大鼠模型，而隨著基因敲除和轉基因小鼠越來越廣泛的應用，穩定的小鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立顯得尤為重要。通過本研究的實施，我們針對小鼠腦缺血再灌注損傷模型的成功建立總結了以下經驗。首先，小鼠具有體重小、相對體表面積較大的特點，在麻醉狀態下小鼠的體溫不易保持，而體溫對缺血損傷程度影響十分大。因此整個手術過程中應該保持手術室恒溫，同時通過加熱墊維持小鼠體溫，并用肛溫計監測整個手術過程中的小鼠體溫。其次，合適的手術設備的選擇十分重要。體視顯微鏡、較精細的顯微手術器械、硅膠材質的具有一定彈性的線栓均是提高手術成功率的保障。第三，缺血區域腦血量流的監測是保證模型穩定的關鍵。激光多普勒血流測定是一種無創的血流監測手段，可以實時監測特定區域的血流供應情況。雖然用于實驗的小鼠的周齡和體重均經過了嚴格的篩選，仍不能排除少數小鼠大腦中動脈直徑存在個體差異，同時由于手術操作過程中存在的偶然因素，部分小鼠可能未能達到理想的血流阻斷以及血流再灌。此時，通過激光多普勒腦血流儀的監測，可以將不符合實驗要求的小鼠剔除，以保證模型的穩定以及實驗結果的可靠。

本研究通過上述模型制備方法，建立了45 min缺血和60 min缺血兩組小鼠腦缺血再灌注損傷模型。實驗結果顯示，45 min和60 min的缺血引起了明顯的腦梗死和神經功能損傷。缺血時間的延長顯著地增加了梗死體積并導致了神經功能的惡化。血腦屏障的破壞是腦缺血再灌注損傷的重要標志，是氧自由基、炎癥因子、金屬蛋白酶等共同作用的結果。本研究通過伊文氏藍能夠通過破壞的血腦屏障滲透進入腦組織的原理，檢測兩組小鼠血腦屏障破壞的情況，實驗結果表明，缺血時間的延長會顯著導致血腦屏障破壞程度的加重。

缺血再灌注損傷后神經元的凋亡是引起神經功能損傷和腦梗死體積擴大的主要原因。細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA，基因組DNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶的催化下連接上熒光素標記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡檢測，即Tuenl染色。Tunel染色是目前國際上公認的凋亡細胞標測方法。本研究通過Tunel和神經元標志物Neun的雙染，檢測了梗死周邊區神經元的凋亡水平，實驗結果顯示缺血時間的延長顯著增加了凋亡細胞的比例。

氧化應激是缺血再灌注時引起細胞損傷的一個重要病理機制。氧自由基可以直接損傷細胞的核酸以及細胞膜的脂質從而引起細胞的死亡。8OHDG和4HNE是反映氧化應激水平的兩個重要標志。8OHDG是DNA氧化損傷的標志物，4NHE則是脂質氧化損傷的標志物[9]。本研究通過8OHDG和4HNE的免疫熒光染色證實在缺血側的腦組織中存在大量的氧化應激損傷的細胞。60 min缺血時間相對45 min缺血時間，顯著加重了氧化應激損傷的程度。

綜上所述，本研究摸索、建立了一種穩定的小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，證實了缺血時間的延長能顯著加重腦缺血再灌注損傷的程度，具體表現在梗死體積增大、神經功能損傷加重以及血腦屏障破壞程度加劇這三個方面。缺血時間的延長還增加了缺血腦組織神經元的凋亡和氧化應激損傷。本研究將為今后以小鼠為實驗對象的腦缺血再灌注損傷研究提供重要的技術參考。

參考資料：

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[4]張連峰,秦川.小鼠基因工程與醫學應用[M].北京:中國協和醫科大學出版社,2010:24-25.

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[6]Wang L,Lu Y,Zhang X,et al.Mindin is a critical mediator of ischemic brain injury in an experimental stroke model[J].Exp Neurol, 2013,247:506-516.

[7]Xia CF,Smith RS Jr,Shen B,et al.Postischemic brain injury is exacerbated in mice lacking the kinin B2 receptor[J].Hypertension, 2006,47:752-761.

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[9]Wang L,Lu Y,Deng S,et al.SHPS-1 deficiency induces robust neuroprotection against experimental stroke by attenuating oxidative stress[J].J Neurochem,2012,122:834-843.

Establishment and evaluation of a murine cerebral ischemia-reperfusion model.

WANG Lang1,2,LU Yan-yun2, ZHOU Qin3,SHUI Xiao-lan1.1.Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060, Hubei,CHINA;2.Cardiovascular Research Institute of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;3.Department of Neurology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo establish a murine cerebral ischemia-reperfusion model and a scientific evaluation system for the model,and to evaluate the effect of prolonged ischemia time on ischemia reperfusion injury.MethodsTransient middle cerebral artery occlusion was used for establishing the murine cerebral ischemia-reperfusion model.Neurological score,TTC staining,Evan's blue staining,Tunel staining and immunofluorescence technique were used to compare the infarct volume,neurological deficit,blood brain barrier(BBB)disruption,neuronal apoptosis and oxidative injury between 45 min ischemia and 60 min ischemia.ResultsCompared with 45 min ischemia,60 min ischemia increased infarct volume by 78.21%,neurological score by 31.66%,neuronal apoptosis rate by 44.49%,and significantly exacerbated BBB disruption and oxidative injury.ConclusionStrict operation and rigorous intraoperative monitoring can obtain stable murine ischemia-reperfusion injury model.Prolonged ischemic time led to worsened brain injury.

Cerebral ischemia-reperfusion;Apoptosis;Oxidative stress;Mice

R-332

A

1003—6350（2014）20—2965—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.20.1168

2014-08-13)

國家自然科學基金（編號：81100230）；國家科技支撐項目（編號：2011BAI15B02、2012BAI39B05）

王朗。E-mail：wlang81@gmail.com