氯沙坦對5/6腎切除慢性心衰大鼠的影響

夏雪，崔寒玥，陳丁丁

中國藥科大學臨床藥學教研室，南京 210009

氯沙坦對5/6腎切除慢性心衰大鼠的影響

夏雪，崔寒玥，陳丁丁*

中國藥科大學臨床藥學教研室，南京 210009

目的：主要探討氯沙坦對5/6腎切除慢性心衰模型大鼠心血管的影響。方法：雄性SD大鼠30只隨機分為假手術組（Sham）、病理組（Nx）和氯沙坦治療組（Lst）。Nx組和Lst組行5/6腎切除術，Lst組于術后第7周初于飲水中連續兩周給予氯沙坦（10 mg·kg-1·d-1）治療。8周末處理所有大鼠，測定血流動力學參數、心指數、血管舒張度、血清肌酐、尿素氮以及心肌和血管組織中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。結果：與Nx組比較，Lst組大鼠LVEDP降低，LVSP、LVDP絕對值升高，心指數降低，血管舒張度增大，血清中肌酐、尿素氮降低，各組織中MDA含量降低，SOD活性升高，結果有顯著性差異或極顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。結論：氯沙坦能夠改善慢性心衰大鼠左心肥厚、左心和血管內皮功能；降低心肌和血管組織中MDA含量并提高SOD活性，減輕組織氧化應激，對心血管產生有益作用。

氯沙坦；慢性心衰；心血管；氧化應激

心腎綜合證（Cardiorenal Syndrome，CRS）是指心臟和腎臟其中一個器官的生理病理紊亂引起的急性或慢性功能障礙可誘發另一器官的急性或慢性功能障礙，Ronco等[1]將其分為5個亞型，其中尿毒癥引起的心臟病變屬于Ⅳ型CRS。一氧化氮-活性氧簇（NO-ROS）失衡、腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）和交感神經系統激活以及炎癥都會加重心衰與腎衰[2]。氯沙坦（losartan，LST）作為一種選擇性血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）受體（AT1受體，Angiotensin type 1 receptor）拮抗藥，可作用于腎素-血管緊張素系統（RAS）。本文通過5/6腎切除術制備慢性心衰大鼠病理模型[3]來研究氯沙坦對尿毒癥慢性心衰大鼠心血管的影響。

1 材料

1.1 儀器

722光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠）；752型紫外分光光度計（上海菁華）；Medlab-U/ 4C501H生物信息采集系統（南京美易科技有限公司）；壓力傳感器（40 Kpa，北京新航）；BL-420F生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；JZ100型張力換能器（北京新航）；電子天平（BS124S，北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 藥物和試劑

云南白藥（云南白藥集團股份有限公司，ZK12022）；吸收性明膠海綿（金陵藥業，110819）；戊巴比妥鈉（德國分裝，WS20080118）；氯沙坦鉀片（默沙東，120802）；肌酐（Cr）試劑盒（南京建成，20131224）；尿素氮（BUN）試劑盒（南京建成，20131225）；考馬斯亮藍G-250（上海化學試劑有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，Biosharp，Lot.738328）；十二烷基硫酸鈉（SDS，上海衛輝化學試劑廠）；硫代巴比妥酸（TBA，國藥集團化學試劑有限公司，Lot. YF20060925）；TEP（1，1，3，3-Tetraethoxypropane，Fluka，G00877）；焦性沒食子酸（貴州遵義市第三化工廠，批號991203）；苯腎上腺素（Phenylephrine hydrochloride/PE，Sigma，116K1492）；乙酰膽堿（Acetylcholine/Ach，Sigma，116K0689）；硝普鈉（Sodiumnitroprusside/SNP，上海山浦公司，批號20051110）。

1.3 動物

清潔級（SPF）雄性SD（Sprague Dawley）大鼠，體重（160±20）g，由南京市江寧區青龍山實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（浙）-2008-0033；飼料為定制的高磷高鈣（Ca：1.13%；P：0.94%，以保證動物營養及造模成功率），亦由其提供。

2 方法

2.1 分組

采用隨機分組，將30只雄性SD大鼠分為假手術（Sham）組（n=10）、病理（Nx）組（n=10）和治療（Lst）組（n=10）。

2.2 造模方法及治療方案

Nx組和Lst組大鼠用戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）麻醉后，按兩次手術切除法行5/6腎切除術，第一次切除大鼠左腎皮質的2/3，約0.45 g，一周后再摘除整個右腎；Sham組僅剝離腎包膜而不切除腎組織。術后，Sham和Nx組均給予正常飲食和水；Lst組前6周給予正常飲食和水，第7周起連續兩周根據整籠大鼠體重和飲水量將氯沙坦用純水配制成適當濃度，給予10 mg·kg-1·d-1的治療。

2.3 血流動力學測定

8周末，行大鼠頸總動脈左心室插管術，記錄各組大鼠的左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張壓（LVDP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內壓最大上升速率（dp/dtmax）和左心室內壓最大下降速率（-dp/dtmax），評價心功能。

2.4 心指數的測定

8周末，取各組大鼠心臟，生理鹽水洗凈并去除多余脂肪組織，吸干表面水分，迅速剪取左心室，稱左心室及全心重量，計算左心室重量指數：左心室重量/全心重（LVW/HW，g·g-1），左心室重量/體重（LVW/BW，g·kg-1）和全心重/體重（HW/BW，g·kg-1）。

2.5 血清肌酐和尿素氮的測定

8周末對各組大鼠進行頸總動脈取血，3500 r· min-1離心10 min后取上清液，按肌酐和尿素氮試劑盒說明書測定肌酐、尿素氮含量。

2.6 血管舒張度的測定

8周末，分離各組大鼠胸主動脈，去除血管外周脂肪與結締組織，剪制長約4 mm的血管環，懸掛于內盛Krebs溶液（自制，pH 7.4）并通以95%和5% CO2混合氣的37℃恒溫水浴槽中。給予0.5 g靜息張力，平衡1 h左右至穩定后，用苯腎上腺素（PE）預激達穩定并記錄收縮值，按累計濃度（10-9～10-4mol· L-1）給予乙酰膽堿、硝普鈉，每次給藥2 min后記錄舒張值；洗脫1 h，方法同上，用PE預激，按累計濃度（10-9～10-4mol·L-1）給予硝普鈉，每次給藥1 min后記錄血管舒張值。全部舒血管作用以其舒張幅度占PE收縮幅度的百分比表示。

2.7 組織中MDA和SOD活性含量的測定

稱取一定量各組織用生理鹽水進行10%的組織勻漿，4000 r·min-1離心10 min，取勻漿上清液用于總蛋白、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的測定。總蛋白用Bradford法（考馬斯亮藍G-250染料法）測定，MDA采用硫代巴比妥酸法測定，結果用MDA/總蛋白（nmol·mg-1）表示。SOD采用鄰苯三酚自氧化法測定，結果用SOD/總蛋白（U·mg-1）表示。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 血流動力學

Nx組大鼠與Sham組相比LVEDP升高，差異有極顯著性（P＜0.01）；LVSP、LVDP、dp/dtmax、-dp/ dtmax絕對值降低，差異有顯著性或極顯著性（P＜0.05或P＜0.01）。Lst組較Nx組LVEDP降低，差異有顯著性（P＜0.05），與Sham組無差異；較Nx組LVSP、LVDP絕對值明顯升高，差異有極顯著性（P＜0.01），與Sham組無差異；dp/dtmax、-dp/dtmax絕對值較Nx組明顯升高，但差異無顯著性，與Sham組無差異。結果見表1。

表1 各組大鼠血流動力學參數（±s，n=7）

表1 各組大鼠血流動力學參數（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

GroupsLVSP（mmHg）LVDP（mmHg）LVEDP（mmHg）dp/dtmax（mmHg·s-1）-dp/dtmax（mmHg·s-1）Sham152.71±16.35-27.17±3.77-14.62±3.459289.56±1648.83-7465.22±1150.68Nx121.32±16.64**-17.86±2.62**-8.05±4.75**6878.3±1538.78*-5345.06±1550.09*Lst147.67±15.81△△-23.25±4.74△△-13.41±2.41△8264.81±1488.46-6598.67±620.56

3.2 心指數

Nx組大鼠左心室的重量指數LVW/HW、LVW/ BW以及HW/BW均較Sham組大鼠顯著升高（P＜0.01）。Lst組的LVW/HW、LVW/BW以及HW/BW均較Nx組降低（P＜0.05或P＜0.01），與Sham組相比無顯著差異。結果見表2。

表2 各組大鼠心指數參數（±s，n=7）

表2 各組大鼠心指數參數（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

GroupsLVW/HW（g·g-1）LVW/BW（g·kg-1）HW/BW（g·kg-1）Sham0.41±0.031.01±0.092.49±0.12Nx0.48±0.02**1.52±0.23**3.14±0.46**Lst0.43±0.02△1.11±0.03△△2.56±0.11△△

3.3 血清肌酐、尿素氮含量

Nx組的血清肌酐和尿素氮均較Sham組水平明顯升高（P＜0.01）。另外相比于Nx組，Lst組的肌酐差異有極顯著性（P＜0.01），尿素氮差異具有顯著性（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清肌酐和尿素氮含量（±s，n=7）

表3 各組大鼠血清肌酐和尿素氮含量（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

Groups肌酐（mg·dl-1）尿素氮（mg·dl-1）Sham1.85±0.3916.75±2.72Nx2.82±0.2**34.74±6.49**Lst2.36±0.36*△△27.10±4.43**△

3.4 血管舒張度

用乙酰膽堿（Ach）舒張血管時，Sham組最大舒張度為76.83%，而Nx組僅有49.43%，Nx組較Sham組血管的舒張功能明顯降低，且差異具有極顯著性（P＜0.01）；Lst組最大可達68%，較Nx組有明顯改善，差異具有極顯著性（P＜0.01）。各組經硝普鈉（SNP）舒張后的最大舒張度無顯著差異。結果見表4。

表4 各組大鼠經Ach和SNP刺激后的血管舒張度（±s，n=7）

表4 各組大鼠經Ach和SNP刺激后的血管舒張度（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

GroupsLg[Ach]Lg[SNP]Sham-76.83±11.47-100.2±1.84Nx-49.43±20.37**-99.47±2.18Lst-68.44±13.47△-99.58±2.58

3.5 組織中MDA含量和SOD活性

Nx組心肌和血管組織中MDA的含量均較Sham組升高，差異分別具有極顯著性（P＜0.01）和顯著性（P＜0.05）。Lst組心肌組織中MDA含量較Nx組低，差異具有極顯著性（P＜0.01），血管組織中的MDA差異具有顯著性（P＜0.05）。此外，Nx組心肌和血管組織中SOD酶活性均較Sham組降低，差異具有極顯著性（P＜0.01）。Lst組心肌和血管組織中的SOD酶活性則較Nx組高，且差異具有極顯著性（P＜0.01），但與Sham組無顯著性差異。結果見表5。

表5 各組大鼠組織中MDA含量及SOD活性（±s，n=7）

表5 各組大鼠組織中MDA含量及SOD活性（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

GroupsMDA（nmol·mg-1）SOD（U·mg-1）心肌組織主動脈心肌組織主動脈Sham0.72±0.231.45±0.4539.75±11.5530.10±11.55Nx1.22±0.24**2.06±0.46*21.44±9.36**13.38±9.21**Lst0.90±0.18△△1.58±0.35△35.55±8.32△△27.66±8.32△△

4 討論

有文獻報道5/6腎切除后8周大鼠有明顯的左室心衰現象，其生理病理學特點是左室收縮、舒張功能（主要是舒張）的衰竭和左室心肌肥厚重構[4]。從心指數結果中可以看出，Nx組大鼠較Sham組大鼠發生了明顯的心肌重構，導致了心室肥厚，表明大鼠已有器質性病變，而血流動力學的變化提示大鼠出現心衰，相對于慢性心力衰竭患者的C期，即有器質性心臟病并有心衰癥狀[5]。由左心室重量指數LVW/HW、LVW/BW以及HW/BW結果可發現，在使用氯沙坦治療后，大鼠的心肌肥厚指數較Nx組明顯降低，表明氯沙坦對該模型大鼠的左心室肥厚具有一定的逆轉作用，這與已報道的氯沙坦能減輕高血壓患者左心肥厚[6]和逆轉大鼠壓力負荷型心肌肥厚[7]的結果一致。此外，Lst組血清肌酐和尿素氮較Nx組明顯降低，表明大鼠的腎衰程度因氯沙坦的干預有一定改善，與氯沙坦可增強糖尿病大鼠腎臟抗氧化能力、減輕氧化應激、減少蛋白尿和腎臟損害[8]的結果一致。血流動力學結果顯示，Nx組較Sham組LVEDP升高（P＜0.01），LVSP、dp/dtm、-dp/ dtm絕對值降低（P＜0.05或P＜0.01），提示Nx組大鼠心臟可能因缺血損傷與心肌肥厚導致了心臟收縮與舒張功能的減退，使得LVSP下降，LVEDP升高，容量負荷加重。Lst組較Nx組LVEDP顯著降低（P＜0.05），dp/dtmax、-dp/dtmax絕對值升高顯著（P＜0.05），提示經氯沙坦治療后，大鼠的心肌收縮與舒張能力增強，左室容量負荷減輕，表明氯沙坦確有較好的心臟保護作用。

由血管舒張度測定結果可知，SNP處理時，各組大鼠胸主動脈的血管舒張度無明顯差異，但用Ach處理時Nx組較Sham組的血管舒張功能明顯降低，差異具有極顯著性（P＜0.01），表明5/6腎切除造成了胸主動脈內皮依賴性舒張功能的損傷，提示血管內皮受損。血管內皮的損傷因素包括氧自由基、血管緊張素Ⅱ和炎癥等。在結果中，Lst組心肌和血管組織中MDA含量較Nx組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），SOD活性明顯升高（P＜0.01），提示氯沙坦可使本模型中大鼠心血管組織中SOD活性增強，MDA減少，減輕組織的氧化損傷。目前已有文獻表明可降低高糖狀態下人臍靜脈內皮細胞中的MDA含量，提高SOD活性[9]；能夠抑制氧化應激，減少活性氧簇生成[10]。RAS在心血管疾病中起著重要作用，該系統中的血管緊張素Ⅱ可通過NADPH氧化酶產生氧自由基[11]，氯沙坦作為AT1受體阻斷劑則可阻斷血管緊張素Ⅱ的這一作用。此外，還有文獻報道氯沙坦能夠提高高鹽高血壓大鼠血漿一氧化氮（NO）水平，減少由NADPH介導的過氧化物生成，提高內皮功能[12]等；提示氯沙坦可能通過減輕血管內皮細胞的氧化應激來保護血管內皮。以上都為氯沙坦能夠減輕機體組織的氧化應激，可能是通過AT1受體調節抑制NAD（P）H的活性，保護線粒體功能提供了依據。另有文獻報道，氯沙坦對離體大鼠胸主動脈的舒張作用具有內皮依賴性[13]。本試驗中Lst組血管舒張功能較Nx組明顯改善，差異具有極顯著性（P＜0.01），與Sham組無差異，表明Lst組主動脈內皮損傷較Nx組輕，其他研究結果也提示氯沙坦能夠減少炎癥因子的釋放，從而保護心血管系統，并且對損傷的血管內皮可能具有一定的修復作用，具體機制有待進一步探索。

綜上所述，氯沙坦通過AT1受體阻斷作用逆轉5/6腎切除慢性心衰大鼠模型的心肌肥厚并改善左心和血管內皮功能，增強心血管組織的抗氧化能力，減輕氧化應激的作用確切，這些作用對尿毒癥并發心血管疾病的防治具有極其重要的意義。本試驗為氯沙坦臨床應用提供了一定的理論依據。

[1] Claudio Ronco,Mikko Haapio,Andrew A House,et al. Cardiorenal Syndrome[J].J Am College Cardiology, 2008,52(19):1527-36.

[2] 袁偉杰，邊琪.心腎綜合征的發病及治療[J].中國中西醫結合腎病雜志，2006，7（6）：311-3.

[3] 王晶晶，陳丁丁.腎切除腎衰大鼠致心腎綜合癥模型的實驗研究[J].中國現代藥物應用，2009，3（5）：1-4.

[4] 馮貽東，朱枝祥，陳丁丁.5/6腎切除致慢性腎衰誘發左室心衰大鼠模型的病理生理[J].中國現代藥物應用，2010，4（11）：13-5.

[5] 陳灝珠，樊冰.解讀美國心臟病學院及美國心臟學會關于成人慢性心力衰竭評估和治療指南[J].中華心血管病雜志，2004，32（8）：673-5.

[6] 薛兆利，李明智，許法運.氯沙坦與氨氯地平的降壓療效及對左室肥厚逆轉作用的比較[J].中國新藥與臨床雜志，2001，20（4）：270-2.

[7] 周俊，李東野，陳清枝.大鼠壓力負荷性心肌肥厚與氯沙坦及賴諾普利的預防作用[J].中國臨床康復，2005，9（19）：35-7.

[8] 覃喬靜，鄧華聰.氯沙坦對糖尿病大鼠腎臟抗氧化能力的影響[J].重慶醫學，2004，33（5）：739-40.

[9] 李懿萍，汪穎南，鄧紅，等.氯沙坦對高糖狀態下內皮細胞的保護作用及其機制探討[J].浙江大學學報（醫學版），2006，35（3）：238-43.

[10] 蘇東東，龔志剛.氯沙坦對球囊成形術后血管內膜增生影響的實驗研究[J].華南國防醫學雜志，2009，23（1）：21-7.

[11] Gao PJ,Li Y,Sun AJ,et al.Diferentiation of vascular myofibroblasts induced by transforming growth factor-BI requires the involvement of protein kinase Ca [J].J Mol Cell Cardiol,2003,35:1105-12.

[12] Bayorh MA,Ganafa AA,Eatman D,et al.Simvastatin and losartan enhance nitric oxide and reduce oxidative stress in salt-induced hypertension[J].Am J Hypertens,2005,18(11):1496-502.

[13] 田晶，呂吉元，牛龍剛.氯沙坦對大鼠離體胸主動脈的舒張作用及機制[J].中國臨床藥理學與治療學，2011，16（11）：1252-6.

Effects of Losartan on 5/6 Nephrectomy Rats with CHF

XIA Xue,CUI Han-yue,CHEN Ding-ding*
Department of Clinical Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

Objevtives:To explore the cardiovascular effects of losartan in 5/6 nephrectomy rats with chronic heart failure(CHF).Methods：Thirty male SD(Sprague Dawley)rats were randomly divided into sham group(sham),pathology group(Nx)and losartan group(Lst).Nx group and Lst group were induced by 5/ 6 nephrectomy.Rats in the Lst group were given losatan(10 mg·kg-1·d-1)through drinking water from the beginning of the postoperative 7th week to the end of the 8th week.At the end of the 8th week,all rats were measured for hemodynamic parameters,cardiac index,vasodilation degrees,serum creatinine and urea nitrogen,and the malondialdehyde(MDA)contents and superoxide dismutase(SOD)activities in myocardium and aorta tissues.Results：Compared with the Nx group,rats in the Lst group had decreased LVEDP, cardiac index,serum urea nitrogen and creatinine,and tissue MDA content;and increased LVSP,LVDP, vasodilation and tissue SOD activity.The differences were significant or very significant(P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion：Losartan can improve left ventricular hypertrophy and the left ventricular and vascular endothelial functions of rats with CHF.It also may have beneficial effects to the myocardium and aorta tissues by reducing tissue oxidative stress of CHF rats.

Losartan;CHF;Cardiovascular;Oxidative stress

R965

A

1673-7806（2014）03-222-04

夏雪，女，碩士生 E-mail:jyjpxx@163.com

*通訊作者 陳丁丁，男，副教授 E-mail:chdd@cpu.edu.cn

2014-03-09

2014-04-08