HPLC法測(cè)定毛冬青膠囊中具棲冬青苷和毛冬青酸的含量*

趙文珠 ，居文政 ，2**，程小桂 ，臧雨馨 ，孫冰婷 ，談恒山

1南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南京 210029；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床藥理科，南京 210029；3南京軍區(qū)總醫(yī)院，南京 210002

毛冬青膠囊為冬青科植物毛冬青 （Ilex pubescens Hook.et Arn）經(jīng)提取精制而成的制劑。毛冬青是我國(guó)南方常用的中藥，性寒，味苦、澀，具有活血通脈、清熱解毒、祛痰止咳的功效，臨床上廣泛用于治療冠心病、心絞痛、血栓閉塞性脈管炎等[1]。藥理研究表明，毛冬青可明顯提高心肌的cAMP（環(huán)磷酸腺苷）和cGMP（環(huán)磷酸鳥苷）水平，具有抗心律失常等作用[2]。毛冬青主要含有皂苷類成分，其中具棲冬青苷和毛冬青酸為活性成分[3]；但毛冬青膠囊中具棲冬青苷和毛冬青酸的含量測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。本文建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定具棲冬青苷和毛冬青酸含量，為完善質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器

Agilent1100（包括脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器），Chem Station色譜工作站；Mettler AE 240型電子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；Micro-17R型冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Direct-Q5型超純水機(jī) （法國(guó)Millipore公司）；KQ3200型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

毛冬青膠囊 （廣東和平藥業(yè)有限公司，批號(hào)130401、130803、130804）；具棲冬青苷對(duì)照品（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，純度>98%）；毛冬青酸對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度>98%）；超純水由Millipore超純水系統(tǒng)制備；甲醇為色譜純；磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（B）-0.2% 磷酸（D），梯度洗脫（0 min，19%B；10 min，65%B；20 min，81%B；25 min，19%B）；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

在上述色譜條件下，具棲冬青苷和毛冬青酸的理論塔板數(shù)不低于3000，與其他峰分離度均>1.5，對(duì)照品及供試品的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

圖1 毛冬青膠囊HPLC

2.2.1 供試品溶液取毛冬青膠囊10粒，研磨均勻，精密稱取2.25 g，置25 mL三角瓶中，精確加入甲醇20 mL，稱重，超聲處理45 min，再次稱重，用甲醇補(bǔ)足損失重量。搖勻，12000 r·min-1離心10 min，取上清液，水浴揮干，乙酸乙酯超聲振蕩3次，每次2 mL，傾去乙酸乙酯，揮干，1.5 mL 75%甲醇復(fù)溶，12000 r·min-1離心 10 min，取上清液即為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液精密稱取具棲冬青苷和毛冬青酸對(duì)照品適量，加甲醇定容，搖勻，分別制成每1 mL含具棲冬青苷5.75 mg、含毛冬青酸5.64 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。另精密移取各儲(chǔ)備液適量，制成質(zhì)量濃度分別為 4.31 mg·mL-1、4.23 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋成6個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液，各取20 μL進(jìn)行HPLC法測(cè)定。以各成分的峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性范圍：A具棲冬青苷=4.5058C+62.702 （r=0.9995），1.22～521.1 μg·mL-1；A毛冬青酸=6.9937C+135.51（r=0.9991），1.23～289.6 μg·mL-1。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密移取具棲冬青苷和毛冬青酸混合對(duì)照品溶液20 μL，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果表明具棲冬青苷、毛冬青酸的RSD分別為0.04%、0.03%。

精密稱取2.25 g毛冬青膠囊（批號(hào)130401），按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果表明，具棲冬青苷、毛冬青酸的RSD分別為0.72%、1.52%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取2.25 g毛冬青膠囊（批號(hào)130401），按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行操作6份，在上述色譜條件下，測(cè)得具棲冬青苷和毛冬青酸的平均質(zhì)量濃度分別為 570.7 μg·mL-1和 316.6 μg·mL-1，RSD分別為1.82%和1.06%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取毛冬青膠囊，依“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于 0、4、8、10、24 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析。測(cè)得具棲冬青苷和毛冬青酸的RSD分別為1.16%和0.96%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品溶液0.5 mL，分別加入適量的具棲冬青苷和毛冬青酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行操作6份，HPLC法檢測(cè)各成分的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 含量測(cè)定

按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定3個(gè)批次毛冬青膠囊中具棲冬青苷和毛冬青酸的含量，見(jiàn)表2。

表2 3個(gè)批次毛冬青膠囊中2種活性成分的含量（n=3）

3 討 論

3.1 毛冬青膠囊所含成分較多，且含有制劑輔料，樣品前處理較為困難。本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇提取、乙酸乙酯提取和固相小柱萃取，結(jié)果采用甲醇提取，乙酸乙酯萃取（棄去，預(yù)試驗(yàn)時(shí)測(cè)不到具棲冬青苷和毛冬青酸），75%甲醇復(fù)溶后分析結(jié)果較為滿意。

3.2 毛冬青膠囊所含成分復(fù)雜，極性差異較大，等度洗脫很難分離，經(jīng)色譜條件優(yōu)化，選擇梯度洗脫。賴珊等[4]采用乙腈-0.05%磷酸溶液系統(tǒng)梯度洗脫法，進(jìn)行了毛冬青注射液HPLC指紋圖譜研究。李超生等[5]以60%甲醇為流動(dòng)相，HPLC法測(cè)定救必應(yīng)藥材中具棲冬青苷的含量。參考文獻(xiàn)色譜條件，進(jìn)行優(yōu)化，采用甲醇-磷酸溶液系統(tǒng)梯度洗脫法，所得峰形對(duì)稱且分離較好。

3.3 經(jīng)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，具棲冬青苷和毛冬青酸波長(zhǎng)為210～215 nm時(shí)所測(cè)成分響應(yīng)較好，考慮溶劑響應(yīng)的影響，選擇215 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同批次毛冬青膠囊中具棲冬青苷和毛冬青酸的含量相近，說(shuō)明其原料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定。此測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為完善毛冬青膠囊質(zhì)量控制提供參考。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中醫(yī)藥大辭典（上冊(cè)）[M].上海：上海人民出版社，1977：441-3.

[2] 蔡 雄，劉中秋，祝晨蔯，等.毛冬青化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 廣東藥學(xué)，2001，11（1）：4-6.

[3] 熊友香，李 昶，羅憲堂.毛冬青的化學(xué)成分藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中藥材，2002，25（5）：371-4.

[4] 賴 珊，楊立偉，歐國(guó)燈，等.毛冬青注射液HPLC指紋圖譜研究[J]. 中藥材，2009，32（7）：1132-4.

[5] 李超生，張 婷，李林國(guó)，等.高效液相色譜法測(cè)定救必應(yīng)藥材中具棲冬青苷的含量[J].特產(chǎn)研究，2007，29（4）：45-7.